一种免疫层析试纸条及其制作方法与检测方法技术

本发明专利技术提供一种免疫层析试纸条，包括：样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫以及背衬板，硝酸纤维素膜包括检测线与质控线，硝酸纤维素膜还包括双抗线。双抗线设置于检测线与质控线之间。本发明专利技术提供的免疫层析试纸条及其制作方法与检测方法，不仅保留了传统免疫层析检测试纸条操作简便、结构简单、低成本的优点，还有效避免了传统试纸条在待测物高浓度时产生的假阴性现象，有效提高免疫层析法检测的准确性，扩大了线性检测范围；不局限于检测线的信号强度，而是综合利用显示区上三条线的信号强度以及三者信号强度的关系，因而能够准确地判断待测物的浓度，大大提高了免疫层析检测的灵敏度和特异性。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及免疫层析检测技术，特别涉及增加了一条判定线的免疫层析试纸条及其制作方法与检测方法。
技术介绍
免疫层析技术是将免疫标记技术与层析技术结合起来的一种新型检测技术，可以利用标记物的显色特性，实现对待测物的定性、半定量、定量分析。它是以微孔滤膜为固相载体，以待测液为流动相，利用微孔滤膜的毛细作用及虹吸作用引导待测液体向前流动，同时待测液中的相关成分和固定在滤膜上的抗原或抗体发生反应，形成免疫复合物后，滞留在检测线上，通过对标记物颜色的深浅或荧光的光密度分析，从而得到直观的检测结果。目前，大多数商业化的定点即时检测手段主要是以免疫层析试验(ICA)居多，该试验也被称之为横向测流检测(LFT)。免疫层析试验操作非常简单，结合了免疫学实验的原理与薄层色谱技术，加样后即可在规定时间内如10分钟或20分钟左右得到检测结果。免疫层析试纸条主要包含五个部分:加样区(样品垫)、标记区(结合垫)、显示区(硝酸纤维素膜)、吸水区(吸水垫)以及背衬板。样品垫可以是纤维素、玻璃纤维、人造纤维等等滤过性介质，主要目的是过滤样本中的颗粒、调节样本的PH以及结合样本中干扰随后层析反应的成分；结合垫可以是玻璃纤维、聚酯纤维或者人造纤维，主要目的是装载标记物如纳米金标记单抗、二抗等并在层析检测中稳定地释放这些标记物；硝酸纤维素膜的主要作用是固化抗原或者抗体等并提供层析检测反应的场所，在免疫层析实验中主要用接触式或非接触式点样仪在膜上线状固化抗原或抗体等形成检测线(T线)和质控线(C线)；吸水垫一般为高密度的纤维素，是层析反应的动力源，控制着层析反应中待检样品持续流动的方向；背衬则为聚苯乙烯或者其他塑料材料，用于为免疫层析试纸条的层叠结构提供刚性支持。当样品垫加入待检样品如血清、尿液等，如果待检样品中有靶分子，则与结合垫中的标记物反应形成复合物，在毛细作用下通过硝酸纤维素膜向吸收垫方向流动，并被硝酸纤维素膜上固化的相应的抗原或抗体等配体分子捕获(捕获位置分别在检测线和质控线上)而被肉眼或者与标记物对应的设备检测到。根据免疫学反应形式的不同可以将免疫层析试纸条分为两种类型:三明治夹心检测和竞争检测。前者利用检测线上固化的捕获抗体或者抗原对分析物进行捕获固定，同时标记抗体或者抗原对分析物进行标记，由此形成夹心结构复合物，主要用于检测具有多个结合位点的较大分析物，人们熟知的早早孕自检试纸条就是利用这种技术。而竞争检测是待检分析物与检测线上固化的同等分析物竞争结合垫上的抗体或者其他配体标记物，结果的判定与三明治夹心检测法正好相反，主要用于检测只有单个结合位点的小分子分析物。免疫层析试纸条结果的判读主要有以下两种:一是直接肉眼观察检测线是否显色来判断待测物的有无；二是用相关仪器读取试纸条检测线上的信号强度，给出一个定量或半定量的待测物含量，其信号强度和待测物含量呈正相关关系。而免疫层析检测法这种检测模式由于其简便、有效、廉价等优点，在目前的定点即时检测中的市场需求依然十分旺盛，基于此检测模式的各种标记分析方式还在不断被开发并应用到如蛋白检测、核酸检测、病毒学、细菌学、抗生素等领域中。1、现有判定方法容易导致高浓度待测物检验假阴性现象高浓度的待测物中，会有大量的未与标记区抗体结合的游离抗原剩余，该游离抗原层析的速度会快于待测物中与标记区抗体结合形成的免疫复合物的层析速度，从而抢先与T线的抗体相结合，占用结合位点，导致免疫复合物无位点空间和T线结合，从而表现出假阴性。由于免疫层析检测有其操作简单、无需专业人员操作等优点，就要求其所用的免疫层析试纸条必须结构简单、体积短小、便于携带及操作。理论上讲，当在加样区滴加待测物后，经过标记区时，待测物应该与标记的抗体混合接触，特异性结合后形成免疫复合物，形成的免疫复合物再继续向前流经显示区发生反应并显示检测结果。而因为其体积短小，长度较短，当在加样区滴加待测物后，在毛细作用下，待测液体被快速虹吸经过标记区、显示区。因为待测物与标记的抗原或抗体接触的时间较短，必然会存在抗原抗体反应不充分的现象，那么就会有未被捕获的待测物和已经形成的免疫复合物共同虹吸至显色区，而免疫复合物因为比游离待测物空间位阻大，其流动速度要落后于游离的待测物，所以就会有未被捕获的待测物先于免疫复合物到达检测线上，与固定在显示区的抗原或抗体反应，占据理论上本该结合免疫复合物的位点，导致检测线上滞留的免疫复合物减少，检测线上的信号强度就会比理论上的弱，所以容易出现假阴性的结果。2、目前试纸条结果的判读方法中，只要质控线显色，无论是肉眼观察还是仪器读取结果，大都只是观察检测线上的信号强度，结果判定依据单一，容易产生误差。由于传统的基于纳米金的免疫层析试纸条是肉眼直接观察，灵敏度有限，其他方法，例如酶法、银染增强法、化学发光法或是荧光法，有的需要荧光激发，产生化学发光，配合检测设备进行检查，操作复杂且成本较高。本领域技术人员致力于提供，既能够操作简单且成本较低，又能够有效降低免疫层析检测假阴性现象的发生率，具有更高的灵敏度。
技术实现思路
针对现有技术中存在的问题，本专利技术提供一种免疫层析试纸条，硝酸纤维素膜除了检测线与质控线，还包括双抗线，能够有效降低免疫层析检测假阴性现象的发生率，具有更高的灵敏度。本专利技术还提供一种免疫层析试纸条的制作方法。本专利技术还提供一种双抗线免疫层析检测方法，与现有的免疫层析检测中单独质控线辅助判定法相比，能够有效降低免疫层析检测假阴性现象的发生率，灵敏度更高、特异性更强、检测快速且操作简便。本专利技术提供一种免疫层析试纸条，包括:样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫以及背衬板，硝酸纤维素膜包括检测线与质控线，硝酸纤维素膜还包括双抗线。本专利技术的免疫层析试纸条，包含新的判定线，即双抗线，该判定线根据其组成成分命名的，因其含有抗原和抗体，故名为双抗。其中抗体的作用是固定抗原，不参与检测过程中的反应；抗原的作用是在检测过程中捕获标记抗体。进一步地，双抗线设置于检测线与质控线之间。进一步地，双抗线包括抗原，抗原为与待测物相同的纯抗原溶液。进一步地，双抗线还包括与抗原对应的抗体，抗原被抗体结合并固定在硝酸纤维素膜上。进一步地，标记抗体为胶体金、磁性纳米粒子、量子点或上转换纳米材料中的一种。本专利技术还提供一种免疫层析试纸条的制作方法，包括以下步骤:(I)制作标记抗体；(2)将标记抗体固定于结合垫；(3)在硝酸纤维素膜上制作检测线、双抗线及质控线；(4)制作样品垫；(5)在背衬板上依次粘贴样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫，各相邻垫之间相互重叠约1.5mm。硝酸纤维素膜最靠近背衬板，结合垫和吸水垫分别搭接在硝酸纤维素膜的两端，样品垫搭接在结合垫的另一端。进一步地，步骤(3)中在硝酸纤维素膜上制作双抗线包括以下步骤:(31)采用多克隆抗体溶液在硝酸纤维素膜的双抗线区域喷一条待测物的抗体线，抗体线的宽度、长度与检测线的宽度、长度相同；(32)用聚乙二醇(PEG)和N-羟基丁二酰亚胺(NHs)处理过的抗原溶液喷在双抗线区域；(33)双抗线区域发生抗原抗体的免疫反应后，抗体的Fab端(Fab端为一个抗体分子上的两个抗原结合位点)被抗原结合封闭，使得抗原分子通过抗原-抗体结合作用力而间接固定在硝酸纤维素膜上。本专利技术还提供一种使用本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种免疫层析试纸条，包括：样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫以及背衬板，所述硝酸纤维素膜包括检测线与质控线，其特征在于，所述硝酸纤维素膜还包括双抗线。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王侃，陈艳荣，崔大祥，何井华，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：上海;31