(‑)γ‑内酰胺的制备方法技术

本发明专利技术揭示了一种(‑)γ‑内酰胺的制备方法，先通过硫磺矿硫化叶菌(+)γ‑内酰胺酶基因的大肠杆菌工程菌进行发酵，制得相关酶液，然后通过共价结合法固定化γ‑内酰胺酶，最后拆分γ‑内酰胺酶制得(‑)γ‑内酰胺。本发明专利技术中对硫磺矿硫化叶菌(+)γ‑内酰胺酶是一种耐高温且温度稳定性好的酶，80℃处理15min对酶的影响较小，而大肠杆菌的绝大多数蛋白都会变性沉淀，使得纯化方法变得简单有效。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种γ-内酰胺酶的固定化制备及其拆分方法，属于生物工程

技术介绍
(1R,4S)-2-氮杂双环-[2.2.1]-庚烷-5-烯-3-酮((-)γ-内酰胺)是用于制备碳环核苷类抗病毒药物的重要手性中间体。例如用于抗艾滋病的重要药物阿巴卡韦、卡巴韦和用于抗流感病毒的帕拉米韦都能以(-)γ-内酰胺为原料制备。目前制备(-)γ-内酰胺的方法主要有不对称合成法和外消旋体拆分法，外消旋拆分法中的生物酶拆分法由于其独特的优点，受到科研及生产人员的倍加重视和开发。生物酶法拆分主要利用具有高度立体选择性酶对外消旋γ-内酰胺进行拆分，去除(+)γ-内酰胺，获得(-)γ-内酰胺，其反应条件温和、环境污染小、产品的光学纯度高。第一次报道使用生物酶法对外消旋γ-内酰胺进行拆分的是Nakano hiroto等，使用的是脂肪酶。Talor等使用全细胞的转化实验，利用酰胺酶拆分外消旋γ-内酰胺，并取得了较好的拆分效果。之后，Taylor等对食酸丛毛单胞菌(Comomonasacidovorans)中的内酰胺酶进行鉴定、分离和克隆，并将(+)γ-内酰胺酶的基因在大肠杆菌中克隆表达，使得重组后的大肠杆菌能够耐受500g/L的底物，具有较高的工业化潜力。硫磺矿硫化叶菌(Sulfolobussolfataricus)中的(+)γ-内酰胺酶具有较强的温度稳定性、易于纯化，并且具有绝对的立体选择性。国内的相r>关研究相对较少，李海泉等从土壤中筛选得到一株具有高活力的(+)γ-内酰胺酶的微杆菌，经过鉴定为氧化烃微杆菌(Microbacteriumhydrcarbonixydans)，北京化工大学的郑国钧等对来源于的(+)γ-内酰胺酶进行了相关研究，并将其基因成功克隆至大肠杆菌中，构建了(+)γ-内酰胺酶的重组菌株。江南大学的倪晔等将PseudonmascepaciaDSM9959整体细胞进行固定化，并应用于拆分γ-内酰胺。本专利技术使用的酶液来源于带有硫磺硫化叶菌(+)γ-内酰胺酶基因的大肠杆菌工程菌发酵并处理获得。具有较好的拆分效果，由于游离酶在各种理化因素(如温度、压力、有机溶剂、离子强度)下比较容易变性失活，甚至在最适条件下也会部分失活，使得反应时间延长。同时，游离酶在拆分反应后无法回收重复利用，从而增加了生产成本和加大了产物提取的难度。因此游离酶的工业化效果并不理想。
技术实现思路
本专利技术的目的在于解决上述的技术问题，提供一种(-)γ-内酰胺的制备方法。本专利技术的目的通过以下技术方案来实现：(-)γ-内酰胺的制备方法，包括如下步骤：S1、共价结合法固定化γ-内酰胺酶；S2、拆分γ-内酰胺酶制得(-)γ-内酰胺；其中，所述S1包括，S11、预处理步骤：a、洗涤，用2-5倍质量体积比的0.2mol/L、pH＝7.0-9.0的磷酸缓冲液对伯氨基树脂用磷酸盐缓冲液洗涤2-3次，过滤得到洗涤平衡的伯氨基树脂，所述最终树脂的平衡pH值为6.5-8.5；b、预活化，在洗涤后的伯氨基树脂中加入戊二醛溶液进行树脂的预活化，使混合物的终浓度为1％-6％，在室温下连续搅拌4-8h，过滤得到固定前树脂；所述反应式如下：S12、制备酶液：c、菌体制备，将含有硫磺矿硫化叶菌(+)γ-内酰胺酶基因的大肠杆菌工程菌进行发酵，罐上发酵条件为：温度37℃，通气量1vvm，转速偶联溶氧，使溶氧范围为20-50％之间，诱导剂为乳糖，发酵时间16h。离心获得湿菌体；d、将获得的湿菌体按照200g/L置于0.1mol/L、pH＝7.0的磷酸盐缓冲液中进行重悬，菌悬液使用高压匀质机匀质2-5次，压力不低于800bar；e、匀质后的破碎液于80℃处理10-15min，以9000rpm离心5min，去除沉淀杂质，获得上清酶液；S13、共价结合固定化酶：f、混合，将经预处理后的树脂与获得的酶液按1:5-10的比例混合，在室温下搅拌固定12-24h；g、过滤，过滤去除混合后的残留酶液，得到γ-内酰胺酶；所述S2包括，S21，在g得到的γ-内酰胺酶中加入γ-内酰胺和去离子水，在40℃进行搅拌反应，进行拆分转化得到(-)γ-内酰胺，所述γ-内酰胺酶与γ-内酰胺的质量比为1:1。优选地，所述γ-内酰胺酶的蛋白浓度＞0.5g/L。优选地，所述S21中γ-内酰胺的浓度＞300g/L。优选地，所述制备方法制得的(-)γ-内酰胺光学纯度为99.98％。本专利技术的有益效果主要体现在：硫磺矿硫化叶菌(+)γ-内酰胺酶是一种耐高温且温度稳定性好的酶，80℃处理10-15min对酶的影响较小，而大肠杆菌的绝大多数蛋白都会变性沉淀，使得纯化方法变得简单有效。采用伯氨基树脂为原料用共价结合的方式制备固定化酶，由于其含有大量的氨基基团，在经过戊二醛预活化后，戊二醛与氨基结合，形成能够与酶蛋白结合的基团，在酶结合时，酶与活化后的树脂形成稳定的亚氨键，将酶蛋白牢固地固定在树脂上。该方法的优点：1、固定化酶的稳定性提高，不易失活；2、反应完成后，固定化酶与反应液易分开；3、酶与树脂结合紧密，反应液中没有酶残留，减少了产物提取的难度；4、固定化酶可以反复利用多次，大大降低了成本。附图说明图1为本实施例中的HPLC的图谱示意图。具体实施方式以下结合实施例具体说明本专利技术的制备方法：(-)γ-内酰胺的制备方法，包括如下步骤：S1、共价结合法固定化γ-内酰胺酶；S2、拆分γ-内酰胺酶制得(-)γ-内酰胺；其中，所述S1包括，S11、预处理步骤：a、洗涤，取直径为0.15-0.3mm的伯氨基树脂100g，用0.2mol/L、pH＝7.0的磷酸盐缓冲液洗涤2-3次，最终树脂的平衡pH值为6.5-8.5之间，过滤得到洗涤平衡的伯氨基树脂；b、预活化，将洗涤平衡后的树脂加入200ml 0.2mol/L、pH＝7.0的磷酸盐缓冲液，加入24ml浓度为25％的戊二醛溶液，使其终浓度为3％。在室温下搅拌，共价结合6h后，过滤得到固定前树脂。S12、制备酶液：c、菌体制备，将含有硫磺矿硫化叶菌(+)γ-内酰胺酶基因的大肠杆菌工程菌用LB培养基37℃、200rpm培养12h后进罐培养，罐上发酵条件为：温度37℃，通气量1vvm，转速偶联溶氧使溶氧范围为20-50％之间，诱导剂乳糖，发酵时间16h，离心获本文档来自技高网...

【技术保护点】
(‑)γ‑内酰胺的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：S1、共价结合法固定化γ‑内酰胺酶；S2、拆分γ‑内酰胺酶制得(‑)γ‑内酰胺；其中，所述S1包括，S11、预处理步骤：a、洗涤，用2‑5倍质量体积比的0.2mol/L、pH＝7.0‑9.0的磷酸缓冲液对伯氨基树脂用磷酸盐缓冲液洗涤2‑3次，过滤得到洗涤平衡的伯氨基树脂，所述最终树脂的平衡pH值为6.5‑8.5；b、预活化，在洗涤后的伯氨基树脂中加入戊二醛溶液进行树脂的预活化，使混合物的终浓度为1％‑6％，在室温下连续搅拌4‑8h，过滤得到固定前树脂；所述反应式如下：S12、制备酶液：c、菌体制备，将含有硫磺矿硫化叶菌(+)γ‑内酰胺酶基因的大肠杆菌工程菌进行发酵，罐上发酵条件为：温度37℃，通气量1vvm，转速偶联溶氧，使溶氧范围为20‑50％之间，诱导剂为乳糖，发酵时间16h。离心获得湿菌体；d、将获得的湿菌体按照200g/L置于0.1mol/L、pH＝7.0的磷酸盐缓冲液中进行重悬，菌悬液使用高压匀质机匀质2‑5次，压力不低于800bar；e、匀质后的破碎液于80℃处理10‑15min，以9000rpm离心5min，去除沉淀杂质，获得上清酶液；S13、共价结合固定化酶：f、混合，将经预处理后的树脂与获得的酶液按1:5‑10的比例混合，在室温下搅拌固定12‑24h；g、过滤，过滤去除混合后的残留酶液，得到γ‑内酰胺酶；所述S2包括，S21，在g得到的γ‑内酰胺酶中加入γ‑内酰胺和去离子水，在40℃进行搅拌反应，进行拆分转化得到(‑)γ‑内酰胺，所述γ‑内酰胺酶与γ‑内酰胺的质量比为1:1。...

【技术特征摘要】
1.(-)γ-内酰胺的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、共价结合法固定化γ-内酰胺酶；
S2、拆分γ-内酰胺酶制得(-)γ-内酰胺；
其中，所述S1包括，
S11、预处理步骤：
a、洗涤，用2-5倍质量体积比的0.2mol/L、pH＝7.0-9.0的磷酸
缓冲液对伯氨基树脂用磷酸盐缓冲液洗涤2-3次，过滤得到洗涤平衡
的伯氨基树脂，所述最终树脂的平衡pH值为6.5-8.5；
b、预活化，在洗涤后的伯氨基树脂中加入戊二醛溶液进行树脂
的预活化，使混合物的终浓度为1％-6％，在室温下连续搅拌4-8h，
过滤得到固定前树脂；所述反应式如下：
S12、制备酶液：
c、菌体制备，将含有硫磺矿硫化叶菌(+)γ-内酰胺酶基因的大
肠杆菌工程菌进行发酵，罐上发酵条件为：温度37℃，通气量1vvm，
转速偶联溶氧，使溶氧范围为20-50％之间，诱导剂为乳糖，发酵时
间16h。离心获得湿菌体；
d、将获得的湿菌体按照200g/L置于0.1mol/L、pH＝7.0的磷酸
盐缓冲液中进行重悬...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐剑锋，曾淼，宋亮，繆骏颖，李岩，
申请(专利权)人：苏州开元民生科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32