一种检测溶菌酶的试剂盒，本发明专利技术的主要内容是一种基于脱氧核糖核酸循环放大荧光信号用于检测溶菌酶的方法，以及包含该方法所需试剂的试剂盒。本发明专利技术所述的检测方法的要点为采用“一锅煮”的方式，以溶菌酶的适体识别引发，自发进行的脱氧核糖核酸杂交、脱氧核糖核酸靶（链）替换聚合反应，通过脱氧核糖核酸循环技术对溶菌酶的检测提供了显著的放大效应；本发明专利技术所述的试剂盒由两条信号探针、一条引物、聚合酶Klenow和缓冲液NEBuffer组成。本检测方法和本试剂盒具有操作简单、高灵敏性和高特异性检测溶菌酶的优点。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及脱氧核糖核酸(以下简称“DNA”)循环放大技术，具体地说是基于DNA循环放大技术对溶菌酶进行免疫分析检测的试剂盒及测试方法。
技术介绍
溶菌酶又称为N-乙酰胞壁质聚糖水解酶或胞壁质酶，是一种能水解致病菌中黏多糖的碱性酶。主要通过水解革兰氏阳性菌的细胞壁中的胞壁脂多糖而破坏细胞壁，导致细胞壁破裂内容物逸出而使细菌溶解。并且，溶菌酶可以与带负电荷的病毒蛋白直接结合，与DNA脱辅基蛋白形成复盐，使病毒失活。因此，溶菌酶具有抗菌、消炎、抗病毒等作用。该酶广泛存在于鸟类和家禽的蛋清、哺乳动物的唾液、泪液、气管等分泌物中。溶菌酶是多种动物组织的内源性免疫系统的重要组成部分，而且在不同组织处其正常含量也各不相同。很多组织中的溶菌酶含量的变化通常会与某些疾病相关联。例如，血液的尿液中溶菌酶浓度异常意味着血液或肾脏方面的疾病；新生儿体内溶菌酶缺乏可能会导致支气管性肺发育障碍；食谱中溶菌酶缺乏可能会增加患痢疾病的发生。因此，对体内溶菌酶的检测在对很多疾病诊断中起着非常重要的作用。DNA循环放大技术是很多免疫检测中经常用到的方法之一，通常包括等温扩增、滚环复制、杂交链式反应。由于自身信号放大，DNA循环放大技术具有消耗样品量少、快速、灵敏的优势，近年来被广泛应用于DNA、细胞、生物分子和胚胎的检测。将多个反应设计成可以自发循环的过程，从而能够将信号多次放大，这将会有效提高对目标物的检测限同时减少对样品的消耗量。基于此，选择设计合适的信号探针、引物、聚合酶是关键。自从1992年Fleming发现溶菌酶以来，对体内溶菌酶的检测一直在不断的开展，并取得了一定的进展。然而，操作简单、具有高特异性、高灵敏性的溶菌酶检测方法仍然是研究者所关注并不断追求的。本专利技术的试剂盒设计成以溶菌酶的适体识别引发，通过DNA杂交、DNA链(靶)替换、聚合反应循环实现对信号的放大，进而实现对溶菌酶高灵敏和高特异选择性的检测。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种检测溶菌酶的试剂盒，该试剂盒操作程序简单、灵敏度高、特异选择性好，适用于尿液、人体血清中溶菌酶的快速检测。本专利技术中试剂盒的组成为:两条信号探针、一条引物、聚合酶Klenow、缓冲液NEBuffer0为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案为: 1、合成探针1:设计三条寡聚脱氧核糖核苷酸序列(SI，S2，S3)，SI为含有溶菌酶适体序列并修饰四甲基罗丹明荧光基团；S2为一端修饰氨基，便于与磁珠结合，并且其序列部分可以与SI和S3互补；S3则为与S2部分互补的序列。三条寡聚核糖核苷酸序列通过杂交结合在一起，并通过S2上的氨基与羧基修饰的磁珠结合从而形成了信号探针I。2、合成探针2:设计两条寡聚脱氧核糖核苷酸序列(S4、S5)，S4为一端修饰氨基的发卡结构，便于与磁珠结合；S5为一端修饰四甲基罗丹明荧光基团并且其序列能够与S4的茎序列互补。两条寡聚核糖核苷酸序列通过杂交结合在一起，并通过S4上的氨基与羧基修饰的磁珠结合从而形成了信号探针2。3、溶菌酶检测:把溶菌酶，引物(S6)加入到上述合成的探针中，首先溶菌酶通过与其适体互补杂交引发；探针I中SI与S2杂交作用被破坏，部分序列片段被暴露出来；通过引物，在聚合酶和dNTP作用下引发DNA聚合反应，反应延伸的新链将溶菌酶与SI的复合体以及S3替换下来，释放到溶液中；在聚合酶和dNTP作用下引发第二个聚合反应，此时溶菌酶被释放下来，可以进入下一个反应形成一个循环。替换下来的S3遇到信号探针2，通过杂交结合在一起；在引物、聚合酶和dNTP作用下引发聚合反应，S3再次被释放到溶液中，进入下一个反应形成另一个循环。4、荧光强度测试:取上述反应后的上清液稀释后进行荧光测试。本专利技术的主要创新性和优越性为: 1、本专利技术采用“一锅煮”的方法，实验操作简单。2、本专利技术以溶菌酶适体识别引发，可以高特异选择性的检测溶菌酶。3、通过两个DNA循环放大荧光信号，可以高灵敏的检测溶菌酶。【附图说明】图1为本专利技术用于荧光检测溶菌酶的示意图。图2 A为荧光响应曲线；B为工作曲线。【具体实施方式】以下为实施本专利技术的具体示例，其作用在于进一步阐明本专利技术的内容，使阅读者更容易理解，但不构成对本专利技术要求的保护范围的限定或限制。实验条件: F-4500荧光分光光度仪(日立公司)、所用寡聚脱氧核糖核苷酸序列(北京赛百盛生物工程有限公司)、羧基修饰磁性微球(天津倍思乐色谱技术开发中心PSC-3412，粒径0.5-1.0μπι,原液磁珠含量50 mg mL—1)、乙基-(3-二甲基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDAC，天津巴斯夫化工有限公司)、咪唑(天津市博迪化工有限公司)、聚合酶Klenow片段、缓冲液及四种脱氧核苷酸三磷酸的混合物(dNTP)(大连宝生物工程有限公司)、10XKlenow缓冲液的成分:100 mM Tris-HCl, 70 mL MgCljP I mM DTT, pH = 7.5。具体操作过程: 1、信号探针I的制备，用0.1M咪唑盐酸盐溶液(pH 6.8)清洗磁珠三次，将磁珠重新分散到咪唑盐酸盐溶液中使磁珠含量达到50 mg mL—1，向600 μ L洗涤后的磁珠悬浮液中加入I mL EDAC溶液(0.1 M)，活化反应60 min。将200 μ LS2的溶液加入到200 μ L咪唑溶液(0.1 M，pH 6.8)活化反应30 min，然后将其与活化好的磁珠混合，反应12 h，稀释后加入200 μ L SI和S3的溶液，在37°C下杂交I h，磁分离，溶液稀释至500 μ L备用。2、信号探针2的制备，磁珠活化与信号探针I中的相同，将200 μ L S4的溶液加入到200 μ L咪唑溶液(0.1 Μ,ρΗ 6.8)活化反应30 min，然后将其与活化好的磁珠混合，反应12 h，稀释后加入200 μ L S5的溶液，在37°C下杂交I h，磁分离，溶液稀释至500 μ L备用。3、循环反应实验:20 UL (2Χ10_7)信号探针I的悬浮液，40 yL(5X10_7)信号探针2的悬浮液，20 μ L S6 (5.0 μ Μ), 12 μ L Klenow聚合酶缓冲液(10 X )、10 μ LdNTP, I μ L聚合酶(5.0 μ/mL)，待测溶菌酶溶液10 μ L，加去离子水组成120 μ L反应体系，在37°C反应2 h。4、荧光测试:上述反应完经过磁分离后，取上清液稀释到600 μ L进行荧光测试。实验结果: 如图2Α所示，随着溶菌酶浓度的升高，荧光信号强度增加。将每条曲线在575 nm处的峰值荧光扣去空白信号后对浓度作图，工作曲线见图2B所示。当溶菌酶浓度在2.0X 10_13到4.0X 10_n的范围内，荧光响应与其呈线性关系，回归方程为AF = 3.24c + 15.32( AF,a.u.; c, I(T13M)，根据3 σ规则，该试剂盒对溶菌酶的检测限为9.2X 10_14M。【主权项】1.一种用于检测溶菌酶的试剂盒，其特征在于:采用“一锅煮”的方法实现了对溶菌酶高特异性和高灵敏性的检测。2.按照权利要求1所述的用于检测溶菌酶的试剂盒，其特征在于:该试剂盒是基于脱氧核糖核酸循环放大荧光信号的测试方法。3.按照权利要求1所述的用于检测本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于检测溶菌酶的试剂盒，其特征在于：采用“一锅煮”的方法实现了对溶菌酶高特异性和高灵敏性的检测。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：时鹏飞，任锐，郗冬梅，周宏，张书圣，
申请(专利权)人：临沂大学，
类型：发明
国别省市：山东;37
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