D‑叔亮氨酸的一种生物催化制备方法技术

本发明专利技术公开了一种新的利用来源于Symbiobacterium thermophilum内消旋‑二氨基庚二酸脱氢酶(StDAPDH)突变体生物催化剂来还原氨化合成光学纯D‑叔亮氨酸的方法。其特征在于将StDAPDH蛋白质序列的121位或在同源性比较相当于121位的色氨酸(W)替换为亮氨酸(L)，146位或在同源性比较相当于146位的苯丙氨酸(F)替换为亮氨酸(L)，227位或在同源性比较相当于227位的组氨酸(H)替换为苯丙氨酸(F)，并将这三个位点突变组合成三突变体。利用三突变体纯酶建立催化反应体系，配合辅酶NADPH循环体系，还原氨化合成光学纯D‑叔亮氨酸，所合成D‑叔亮氨酸产物的ee值大于99％。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了一种新的利用来源于Symbiobacterium thermophilum内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶(StDAPDH)突变体生物催化剂来还原氨化合成光学纯D-叔亮氨酸的方法。其特征在于将StDAPDH蛋白质序列的121位或在同源性比较相当于121位的色氨酸(W)替换为亮氨酸(L)，146位或在同源性比较相当于146位的苯丙氨酸(F)替换为亮氨酸(L)，227位或在同源性比较相当于227位的组氨酸(H)替换为苯丙氨酸(F)，并将这三个位点突变组合成三突变体。利用三突变体纯酶建立催化反应体系，配合辅酶NADPH循环体系，还原氨化合成光学纯D-叔亮氨酸，所合成D-叔亮氨酸产物的ee值大于99％。【专利说明】
本专利技术属于生物催化领域，涉及一种生物催化剂内消旋-二氨基庚二酸脱氨酶变 体，利用该生物催化剂W a -丽酸为底物还原氨化合成光学纯D-叔亮氨酸。
技术介绍
氨基酸是指既含有氨基的駿酸的有机化合物，不同氨基酸的之间区别在于它们侧 链R基团的不同，自然界中到目前为止共发现有300多种氨基酸，根据是否是构成天然蛋白 质的基本组成成分，氨基酸可分为天然氨基酸和非天然氨基酸，非天然氨基酸是指人工合 成的各种氨基酸。除甘氨酸外，氨基酸都有不对称碳原子，呈旋光性，根据空间排列位置不 同，可W分为D-氨基酸和心氨基酸两种，不同旋光氨基酸在生物体内发挥着不同的生理作 用。叔亮氨酸是一类非天然氨基酸，其侧链为大位阻疏水性叔下基，而且在空间上很接近氨 基和駿基，含有叔亮氨酸的肤键很难被降解，因而增加了相关化合物酶解稳定性，由于大位 阻能很好的控制分子构象，该些特征使得叔亮氨酸成为重要的医药中间体和不对称合成的 手性诱导模板及催化剂【Bommarius, A. S.，et. al (1995). Tetr址e化on :Asvmmetrv6 (1 2)： 2851-2888】。 合成光学纯氨基酸的方法主要有；外消旋体拆分法、化学合成法及生物法的化 学和生物合成法。近年来生物法，尤其是酶法转化W其无污染、成本低、产物光学纯度高 的特点已经显示出广阔的市场前景。在叔亮氨酸酶法合成方面，k叔亮氨酸的合成主 要是通过氨基醜化酶拆分【连续化酶法生产k叔亮氨酸，专利号；201010622182】，W及 k 亮氨酸脱氨酶还原氨化进行【Hummel, W.，et. al (2003). Org Letts (20) ;3649-3650 ; Menzel, A. , et. al (2004). Engineering in Life Sciences4 (6) :573_576】。而且已应用 于生产【一种制备k叔亮氨酸的方法，专利号；201110202325 ;-种k叔亮氨酸的生产 方法，专利申请号；2012105080840】。D-叔亮氨酸可W通过一些酶法进行合成，如青霉 素醜化酶【Liu, S. L.，et. al (2006). Prep BiochemBiotechnol36 (3) ;235_241 】、D_ 海因 酶【Turner, R. J.，et. al (2004). Engineering in Life Sciences4 化);517-520】、膳水合 酶/D-醜胺酶【Marion Anso;rge，et.al (2003).EP patent applicationl, 318,193)、蛋 白酶【Laumen, K.，et. al (2001). Biosci Biotechnol Biochem65(9) ;1977-1980】等，但 该些合成方法是对消旋体进行拆分，最高理论产量为50%。氨基酸脱氨酶巧Cl. 4.1.x) 能在辅酶NAD (P) +的存在下，催化氨基酸可逆氧化脱氨/还原氨化反应【化shima，T. et. al (1990). Adv Biochem faiR Biotechnol42 ; 187-209】，能被用来从丽酸底物出发，利用 畑3作为氨基供体合成氨基酸，其副产物是水，而且产物对映体理理论产率为100%，从 经济成本和对环境影响方面考虑，该方法是合成氨基酸的绿色经济的方法【Zhu，D. et. al (2009). Biotechnol T4(10) ;142〇-1431】。已报道的野生型氨基酸脱氨酶多为k选 择性的【Yon址a, K. et. al (1986). AdvBiochem faiR Biotechnol33 ;95-130】，许多酶被 成功用于工业规模生产1^-氨基酸【Ohshima化.al (1990)Bioprocesses and Applied Enzvmology, Springer Berlin/Heide化erg. 42 :187-209 ;Galkin, et.al (1997). Appl Environ Microbiol63 (12) ;4651-4656】。目前没有野生型的D-氨基酸脱氨酶可W用来还 原氨化生成D-氨基酸。内消旋-二氨基庚二酸脱氨酶，值APDH，EC1. 4. 1. 16)可逆催化二氨 基庚二酸D-构型氨基的氧化脱氨/还原氨化，该酶的突变体已经被用来W丽酸为底物，选 择性合成 D-氨基酸【Ve化a-Peters，et. al (2006). T Am Chem Sod28 (33) : 10923-10929 ; Akita,H.,et. al(2012). Biotechnol Lett34巧）；1693-1699 ;Akita, H.，et.al (2013). Appl Microbiol Biotechnol. 1-9】，但是该些报道中的酶均不能合成D-叔亮氨酸，至今也没有利 用氨基酸脱氨酶还原氨化合成D-叔亮氨酸的相关文献报道。 我们先前获得了 一个能还原氨化合成D型氨基酸如D-丙氨酸、D-额氨酸、 D-亮氨酸的内消旋-二氨基庚二酸脱氨酶【Gao, X.，et. al (2012). Appl Environ Microbiol78(24) ：8595-8600 ；Gao, X. , et.al(2013). Appl Environ Microbiol79(16)： 5078-5081】，并申请专利"合成D-氨基酸的一种新方法"【专利申请号；201210334554.6】。 通过对此内消旋-二氨基庚二酸脱氨酶进行蛋白质工程改造，获得了能进行还原氨化合成 D-叔亮氨酸的酶突变体，此酶突变体可作为生物催化剂用来合成光学纯D-叔亮氨酸。
技术实现思路
： 本专利技术提供了一种改造的来源于Symbiobacterium thermo地ihum的内消旋-二 氨基庚二酸脱氨酶（StDAPDH)变体生物催化剂，该催化剂可W被用来还原氨化合成66值> 99 %的D-叔亮氨酸。 突变酶蛋白的获取步骤如下： 1. W祀Tsa-Dap化质粒为模板，通过如ick Qiange Mutagenesis Kit突变试剂盒 引入化21L、F146L、肥27F H位点组合突变，并对突变质粒进行测序验证； 2.将突变质粒W大肠杆菌化21 0E3)为宿主菌构建本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种利用内消旋‑二氨基庚二酸脱氢酶突变体作为生物催化剂来合成光学纯度＞99％D‑叔亮氨酸的方法，包括：对内消旋‑二氨基庚二酸脱氢酶StDAPDH进行组合突变，以获得的组合突变体为生物催化剂，以3，3‑二甲基‑2‑羰基丁酸与氯化铵作为底物构成的反应体系，加入辅酶循环体系进行催化还原胺化反应，制得光学纯度＞99％的D‑叔亮氨酸。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：刘卫东，朱敦明，吴洽庆，陈曦，冯进辉，马延和，
申请(专利权)人：中国科学院天津工业生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：天津;12