表达鼠疫耶尔森氏菌F1-V融合蛋白的伤寒沙门氏菌Ty21a及其用途制造技术

本文描述了用于表达鼠疫耶尔森氏菌F1-V融合蛋白的质粒构建体的产生。在所公开的质粒中，所述F1-V融合蛋白编码序列与大肠杆菌htrA启动子可操作地连接，并且与大肠杆菌HlyA分泌信号序列框内融合。还描述了包含所述F1-V融合蛋白表达质粒的肠道沙门氏菌血清变型伤寒沙门氏菌菌株Ty21a，例如用作抗鼠疫的口服疫苗。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】表达鼠疫耶尔森氏菌F1-V融合蛋白的伤寒沙门氏菌Ty21a及其用途相关申请的交叉引用本申请要求于2012年5月23日提交的美国临时申请61/650,676的优先权，所述临时申请以引用的形式全文纳入本文。
本公开内容涉及开发用于产生针对鼠疫耶尔森氏菌(Yersiniapestis)——鼠疫的致病菌——的保护作用的免疫原性组合物。本公开内容还涉及包含F1-V融合蛋白表达构建体的伤寒沙门氏菌(SalmonellaTyphi)菌株Ty21a，及其使用方法。
技术介绍
鼠疫耶尔森氏菌是鼠疫的致病菌。历史上已记录了鼠疫的至少3次大流行，其杀死了近2亿人。鼠疫是人畜共患病(zoonoticdisease)，通常通过被感染的跳蚤的叮咬传播。鼠疫耶尔森氏菌的天然贮存宿主包括啮齿目动物、松鼠和草原犬鼠(prairiedog)。目前，鼠疫耶尔森氏菌的大的贮存宿主存在于除了澳大利亚之外的所有主要人类栖息地(Sunetal.,JInfectDevCtries5(9):614-627,2011)。鼠疫在世界上许多地方流行，包括非洲、中国、印度、南美部分地区和美国西南部(Yangetal.,JImmunol178:1059-1067,2007；Learyetal.,MicrobPathog23:167-179,1997)。最近的流行病学研究表明，全世界每年有大约4000个人类鼠疫病例(Sunetal.,JInfectDevCtries5(9):614-627,2011)。因此，鼠疫仍然是严重的公共健康问题。鼠疫最常表现为腺鼠疫，其特征在于突然发热以及靠近跳蚤叮咬处的淋巴结肿痛(“炎性淋巴腺肿”)。用抗生素迅速治疗通常是有效的(Mortonetal.,Vaccine22:2524-2532,2004)。但是，细菌能够从跳蚤叮咬处广泛传播，并且在某些情况下，会感染肺部。如果肺部被感染，鼠疫可在由咳嗽或喷嚏所产生的气溶胶中传播，导致原发性肺鼠疫的爆发(Learyetal.,MicrobPathog23:167-179,1997)。肺鼠疫是高度传染性的，并且通常是致命的(Mortonetal.,Vaccine22:2524-2532,2004)。因为鼠疫是高度传染性的，并且能通过气雾化传播，鼠疫耶尔森氏菌被认为是潜在的生物武器(Sunetal.,JInfectDevCtries5(9):614-627,2011；Yangetal.,JImmunol178:1059-1067,2007)。
技术实现思路
本文公开了用于表达鼠疫耶尔森氏菌F1-V融合蛋白的质粒构建体的产生。还公开了包含所述公开的质粒构建体的肠道沙门氏菌血清变型伤寒沙门氏菌菌株Ty21a(称为“伤寒沙门氏菌Ty21a”或“Ty21a”)，例如用作抗鼠疫的疫苗。本文提供了重组核酸分子，包含可操作地连接到诱导型启动子的鼠疫耶尔森氏菌F1-V融合蛋白编码序列，所述诱导型启动子在真核宿主细胞中具有活性，如大肠杆菌(Escherichiacoli)htrA启动子。在某些实施方案中，所述核酸分子包含与SEQIDNO:1的核苷酸1-1558至少85％相同的序列。在一些实施方案中，所述核酸分子还包含分泌信号肽编码序列(如大肠杆菌HlyA分泌信号序列)，其与F1-V融合蛋白编码序列框内融合。在具体的非限制性实施例中，所述核酸分子包含SEQIDNO:1的序列。还提供了包含所公开的核酸分子的质粒，以及包含所公开的核酸分子或质粒的伤寒沙门氏菌Ty21a细菌。在一个非限制性实施方案中，提供了重组核酸分子，其包含与大肠杆菌htrA启动子序列可操作地连接的鼠疫耶尔森氏菌F1-V融合蛋白编码序列，以及与所述F1-V融合蛋白编码序列框内融合的大肠杆菌HlyA分泌信号肽编码序列，其中所述核酸分子的序列包含SEQIDNO:1。还提供了包含所述核酸分子、复制起点、选择性标记以及大肠杆菌HlyB和HlyD蛋白编码序列的质粒。还提供了包含所述质粒的伤寒沙门氏菌Ty21a。还提供了免疫原性组合物，其包括包含F1-V表达质粒的伤寒沙门氏菌Ty21a和可药用载体。本公开内容还提供了在受试者中引起针对鼠疫耶尔森氏菌的免疫应答的方法，所述方法是通过给予所述受试者包含F1-V表达载体的伤寒沙门氏菌Ty21a或是通过给予本文所公开的免疫原性组合物进行。还提供了在受试者中预防鼠疫、降低发生鼠疫的风险或治疗鼠疫的方法，所述方法是通过给予所述受试者包含本文所公开的质粒或重组核酸分子的伤寒沙门氏菌Ty21a或是通过给予如本文所公开的免疫原性组合物进行。根据以下参考附图进行的详细描述，本专利技术的前述和其他目的、特征和优点将会变得更加显而易见。附图说明图1是克隆到质粒pHtrF1-V-Hly中的所述合成F1-V融合DNA插入片段的示意图。图2是质粒pHtrF1-V-Hly(9407bp)的示意图，其由克隆到低拷贝质粒pGB-2中的鼠疫F1-V基因融合构建件组成。所述pGB-2复制起点(ORI)的位置与可选择的大观霉素抗性基因(spcR)相邻。所述合成的基因融合插入片段是由与F1-V基因连接的(其通过修饰的接头(linker)序列相互融合)并且与HlyA细胞外分泌信号(HlyAs)连接的htrA启动子组成。所述质粒还包括分泌机器蛋白HlyB和HlyD的编码序列。图3示出了通过SDS-PAGE对蛋白质提取物进行的分析。使用pHtrF1-V-hly(包含鼠疫耶尔森氏菌F1-V融合蛋白)或pHtrPAcm-hly(包含炭疽芽孢杆菌保护性抗原(PA)；如记载于Osorioetal.,InfectImmun77(4):1475-1482,2009)转化伤寒沙门氏菌Ty21a。使培养物过夜培养，并收集培养物上清液(S)和细胞沉淀(P)。通过SDS-PAGE分析蛋白质提取物，并用市售的抗F1单克隆抗体或抗V单克隆抗体探测。用pHtrF1-V-hly转化的伤寒沙门氏菌Ty21a产生并分泌所述F1-V融合蛋白(58kDa)。图4的两个图示出了针对F1-V和PA抗原的总的血清IgG效价。通过腹膜内途径，使用3个每两周一次的剂量(含有产生F1-V或之前构建的炭疽杆菌PA的伤寒沙门氏菌Ty21a)免疫10只6-8周龄小鼠的组。第三组小鼠接受了产生F1-V的Ty21a和产生PA的Ty21a的1:1的混合物。对照组小鼠接受了3个剂量的用空pGB-2载体转化的Ty21a。经免疫的小鼠接受了2-5×107菌落形成单位形成单位(CFU)/剂量。在第三次和最后一次免疫后一周收集血清。通过ELISA分析总的循环F1-V特异性和PA特异性的IgG效价。图5的图表示出了针对F1-V抗原的总的血清IgG效价。每两周使用以F1-V质粒或空pGB-2载体转化的伤寒沙门氏菌Ty21a，通过腹膜内途径，免疫8周龄小鼠(每个时间点每一组n＝5)3次。在0周、2周和4周时，小鼠接受了2-5×107菌落形成单位(CFU)/剂量。在0、1、3和5周时，收集来自每次处理的5只小鼠的血清。通过ELISA分析总的循环F1-V特异性的IgG效价。图6A-6D的图表示出了对rF1-V的脾细胞体外回忆应答。未对10只6-8周龄小鼠的组进行免疫，或者通过腹膜内途径使用3个每两周一次的剂量(含有产生F1-V或空pG本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种重组核酸分子，包含与大肠杆菌htrA启动子序列可操作地连接的鼠疫耶尔森氏菌(Yersinia pestis)F1‑V融合蛋白编码序列，其中所述核酸分子包含与SEQ ID NO:1的核苷酸1‑1558至少95％相同的序列。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2012.05.23 US 61/650,6761.一种伤寒沙门氏菌(SalmonellaTyphi)Ty21a细菌，其包含含有重组核酸分子的质粒，其中所述重组核酸分子包括：与大肠杆菌htrA启动子序列可操作地连接的鼠疫耶尔森氏菌(Yersiniapestis)F1-V融合蛋白编码序列；和与F1-V融合蛋白编码序列框内融合的大肠杆菌HlyA分泌信号肽分泌信号肽编码序列，其中所述重组核酸分子的序列为SEQIDNO:1。2.权利要求1的伤寒沙门氏菌Ty21a细菌，其中所述质粒是低拷贝数质粒。3.权利要求1的伤寒沙门氏菌Ty21a细菌，其中所述质粒包含选择性标记。4.权利要求3的伤寒沙门氏菌Ty21a细菌，其中所述选择性标记是抗生素抗性...

【专利技术属性】
技术研发人员：D·J·埃科，M·奥索里奥，M·R·富特，
申请(专利权)人：美国政府由卫生和人类服务部的部长所代表，
类型：发明
国别省市：美国;US