本发明专利技术公开了一种高效的丙型肝炎病毒核心抗原酶联免疫检测试剂盒。它主要包括酶标板、抗HCV-cAg酶结合物、HCV-cAg标准品梯度溶液、阳性血清对照指示样本、阴性血清对照指示样本、HCV-cAg样品稀释液、底物液A、底物液B、终止液、20×浓缩洗涤液。本发明专利技术制得的试剂盒灵敏度高、精密度好、特异性强。
【技术实现步骤摘要】
一种高效的丙型肝炎病毒核心抗原酶联免疫检测试剂盒
本专利技术涉及病毒抗原检测试剂盒，尤其涉及一种高效的丙型肝炎病毒核心抗原 (HCV-core Ag)酶联免疫检测试剂盒。
技术介绍
丙型病毒性肝炎，简称为丙型肝炎、丙肝，是一种由丙型肝炎病毒（Hepatitis C virus，HCV)感染引起的病毒性肝炎，丙型肝炎呈全球性流行，可导致肝脏慢性炎症坏死和 纤维化，部分患者可发展为肝硬化甚至肝细胞癌（HCC)。一些数据显示，未来20年内与HCV 感染相关的死亡率(肝衰竭及肝细胞癌导致的死亡）将继续增加，对患者的健康和生命危害 极大目前，慢性丙肝除了干扰素有确切的疗效外，尚没有其它有效的治疗方法，而且疫苗的 研制在短期内难有突破性的进展，因此，早发现、早诊断、早治疗对于丙肝患者有十分重要 的意义。 丙型病毒性肝炎的诊断根据病程可分为急性和慢性丙型肝炎。根据临床症状可分 为轻、中、重度丙型肝炎。肝硬化和肝癌是HCV感染的最严重后果。与其它病毒（HBV、HIV) 的重叠、合并感染统称为混合感染。肝脏移植后HCV感染可以复发。丙型病毒性肝炎毒血症 6个月以上为慢性感染，自然转阴率低慢性率高75 %?80%。感染10?20年，至少20% 患者发展为肝硬化。10年生存率仅为25%?80%。肝癌发生率3年后为1 %?3%。 在生化学检测中，丙氨酸氨基转移酶(ALT )和天门冬氨酸氨基转移酶（AST )可反映 肝细胞损害程度，但ALT和AST与炎性分布和病情的严重程度不一定成正比。ALT下降表 示抗病毒治疗有效，凝血酶原时间为作为慢性丙型肝炎患者病情进展的监测指标。但是这 种方法只能作为判定丙肝的一项辅助性的依据，特异性不强，无法准确的检测出肝炎。 HCV核心抗原的检测是一种新型的检测方法，研究始于上世纪九十年代中期，应用 最广泛的是酶免疫方法。美国Ortho公司首先推出了双抗体夹心法定性和定量检测血清样 品中总的或游离的HCV核心抗原ELISA试剂盒，于2004年已经在欧洲上市。近年来在我国 陆续出现，但是HCV核心抗原的酶联免疫法灵敏度不高，因此其推广使用也受到局限。所 以专利技术一种既操作简便又灵敏度高的试剂盒具有非常重要的临床意义。
技术实现思路
针对现有的丙型肝炎抗原酶联免疫检测试剂盒灵敏度不高，特异性不够强等问题 的，本专利技术提供了一种高效的丙型肝炎病毒核心抗原酶联免疫检测试剂盒。 本专利技术采用以下技术方案： 一种高效的丙型肝炎病毒核心抗原酶联免疫检测试剂盒，它主要包括酶标板、抗 HCV-cAg酶结合物、HCV-cAg标准品梯度溶液、阳性血清对照指示样本、阴性血清对照指示 样本、HCV-cAg样品稀释液、底物液A、底物液B、终止液、20X浓缩洗涤液，其特征在于：所述 HCV-cAg样品稀释液的配方及制法是： 将羊血清100ml、氯化钠10g、硫柳萊10g、亚铁氰化钾42. 24g、聚氧乙烯月桂醚10g、 庆大霉素 IOg加入到0. IM pH=7. 4的TriS-HCl缓冲液中至1L，物质充分溶解后过滤除菌， 2-8 °C保存。 0? IM pH 7. 4的TriS-HCL的缓冲液的配置方法为：使将12. IlgTris溶于IL去离 子水中，使用盐酸将溶液的PH值调整到7. 4即得。 所述20X浓缩洗涤液的配方及制法是：将2. 96g NaH2PO4 ? 2H20、29g Na2HPO4? 12H20、IOg氯化钠、IOg十二烷基硫酸三乙醇胺加入到去离子水中至1L，充分溶解后，过滤 除菌，2-8 °C保存。 所述阴、阳性血清对照指示样本均来源于人员基质血清，对所捐献者的血清进行 灭活处理。 所述底物液A是通过下述方法制备的：将12. IlgTrisUg铁氰化钾、5g焦磷酸钠 和lmL30%双氧水依次溶于IL蒸馏水中，混合均匀； 所述底物液B是通过下述方法制备的：将5 g TMB溶解到10 mL二甲基亚砜中，再将其 混合液加入蒸馏水中至1L，最后依次加入2. 96g NaH2PO4 *2H20和29g Na2HPO4 *12H20溶解 完成制备。 所述酶标板为各孔包被有4 ii g/ml的包被抗体Mabl和Mab2的聚苯乙烯96圆孔 酶标板； 抗体在96孔酶标板上的包被方式：将提纯好的Mabl和Mab2用pH5. 0酒石酸缓冲液分 别稀释至4 ii g/mL和4 ii g/mL浓度，每孔加100 ii L于检测板孔内，在2-8°C环境下放置12 小时，弃去包被液，用洗漆液清洗5-8次,然后轻轻用手拍干上面的液体。然后加入牛血清 白蛋白封闭液IOOu L/孔，2-8°C封闭10-12小时，随后将封闭液弃去，室温干燥3-5小时， 等到酶标板干燥后，使用真空封口包装，并将封装好的板存于2-8°C冰箱中，保存备用。 所述抗HCV-cAg酶结合物为辣根过氧化酶标记的羊抗人的Mab3和Mab4抗体； 所述的包被抗体Mabl、Mab2、Mab3、Mab4都是采用单克隆技术提取的高纯度抗体。 所述HCV-cAg标准品梯度溶液分为5个浓度，分别为40ng/m L、20ng/m L、10ng/m L、5ng/m L、80pg/mL〇 所述终止液为2ml浓盐酸和2ml浓硫酸。 本专利技术的试剂盒的使用方法如下： (1) 平衡：样品及检测试剂盒内的试剂，于18_25°C平衡30分钟； (2) 配液：将试剂盒中配套的20X浓缩洗涤液用去离子水稀释20倍，量取300mL，制 成工作所需浓度洗涤液，为下面洗板做好准备； (3) 样品预处理：预处理板上每孔按1: 2的比例加入样本稀释液和样品，45-60°C振 荡孵育60分钟，待用； (4) 加样：取96孔酶标板，预设置空白、阴性、阳性对照各3孔，空白对照每孔加入 100 样品稀释液，其余孔每孔中先加入50 iU样品稀释液，然后阴、阳性对照孔每孔加入 50 iU相应对照血清，剩余孔样品检测孔，将经上述预处理的各待测样品按设定每孔中加入 50 ii 1，这样每个孔中都有100 ii 1的液体，加样完毕后用不干胶封片封盖反应板，37°C振荡 孵育60分钟； (5) 洗板：倒去板孔中的液体，并用吸水纸吸干上面的液体；用工作浓度洗涤液洗板 5-6次，最后拍干； (6) 加抗HCV-cAg酶结合物：每孔中加入75IU抗HCV-cAg酶结合物，用不干胶封片封 盖反应板，37 °C孵育30分钟； (7) 洗板：同步骤（5); (8) 显色：每孔中先后加入底物液A、底物液B各50 iil，避光显色至少2分钟； (9) 测定：显色反应后，将酶标板置酶免疫上测出各孔的吸光度变化； (10) 以阴性对照吸光度变化（RLU)的平均值+2270为临界值（CUTOFF);待检样品的 RLU值> 临界值（CUTOFF)为阳性，待测样品RLU值< 临界值（CUTOFF)为阴性为判定标准进 行判定。 与现有技术相比，本专利技术具有以下突出优点： 1、 本专利技术在样本稀释液中选取了亚铁氰化钾替换原有的铁氰化钾，能够保护体系中其 他成分，延缓被氧化的速度，提高了试剂的稳定性； 2、 在整个反应体系中，本专利技术在样本稀释液体中加入了聚氧乙烯月本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种高效的丙型肝炎病毒核心抗原酶联免疫检测试剂盒，它主要包括酶标板、抗HCV‑cAg酶结合物、HCV‑cAg标准品梯度溶液、阳性血清对照指示样本、阴性血清对照指示样本、HCV‑cAg样品稀释液、底物液A、底物液B、终止液、20×浓缩洗涤液，其特征在于：所述HCV‑cAg样品稀释液的配方及制法是：将羊血清100ml、氯化钠10g、硫柳汞10g、亚铁氰化钾42.24g、聚氧乙烯月桂醚10g、庆大霉素10g加入到0.1M pH=7.4的Tris‑HCl缓冲液中至1L，物质充分溶解后过滤除菌，2‑8℃保存；所述20×浓缩洗涤液的配方及制法是：将2.96g NaH2PO4 ·2H2O、29g Na2HPO4 ·12H2O、10g氯化钠、10g十二烷基硫酸三乙醇胺加入到去离子水中至1L，充分溶解后，过滤除菌，2‑8℃保存。
【技术特征摘要】
1. 一种高效的丙型肝炎病毒核心抗原酶联免疫检测试剂盒，它主要包括酶标板、抗 HCV-cAg酶结合物、HCV-cAg标准品梯度溶液、阳性血清对照指示样本、阴性血清对照指示 样本、HCV-cAg样品稀释液、底物液A、底物液B、终止液、20X浓缩洗涤液，其特征在于：所述 HCV-cAg样品稀释液的配方及制法是： 将羊血清100ml、氯化钠10g、硫柳萊10g、亚铁氰化钾42. 24g、聚氧乙烯月桂醚10g、 庆大霉素l〇g加入到〇. 1M pH=7. 4的Tris-HCl缓冲液中至1L，物质充分溶解后过滤除菌， 2-8 °C保存； 所述20X浓缩洗涤液的配方及制法是：将2. 96g NaH2P04，21120、298 Na2HP04 *121120、 l〇g氯化钠、l〇g十二烷基硫酸三乙醇胺加入到去离子水中至1L，充分溶解后，过滤除菌， 2-8 °C保存。2. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于： 所述底物液A是通过下述方法制备的：将...
【专利技术属性】
技术研发人员：谭柏清，罗维晓，甘宜梧，李静，赵新，朱玉娥，肖慧，
申请(专利权)人：山东博科生物产业有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37
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