利用搅拌式细胞培养转瓶机快速制备饲养层细胞的方法技术

本发明专利技术公开了一种利用搅拌式细胞培养转瓶机快速制备Feeder细胞的方法，包括CF-1MEFs原代获取、CF-1MEFs传代培养和CF-1MEFFeeder制备等三个步骤；制备CF-1MEFFeeder时以搅拌式细胞培养转瓶机作为细胞处理设备，转瓶机的搅拌锤可在电磁场作用下不断旋转，使细胞在悬浮状态下与培养液中的MMC充分接触，可提高MMC抑制细胞增殖的效率，缩短处理时间；转瓶机专用培养瓶的容积是普通培养瓶/皿的几倍甚至上百倍，培养瓶能重复使用，可节省大量细胞培养瓶/皿，降低Feeder的制备成本，提高Feeder制备效率，节约大量实验时间；另外本方法是在悬浮状态下处理细胞，回收细胞时无需消化液处理，可减少消化对细胞带来的损伤，最大限度地保持细胞的良好状态。

【技术实现步骤摘要】
利用搅拌式细胞培养转瓶机快速制备饲养层细胞的方法
本专利技术涉及一种饲养层(Feeder)细胞的制备方法，具体涉及一种利用搅拌式细胞培养转瓶机快速制备饲养层细胞的方法，属于体外细胞培养

技术介绍
诱导型多潜能干细胞（inducedpluripotentstemcells，iPSCs）很多特性与胚胎干细胞极为相似，能分化为几乎所有的成体细胞，由于其可通过细胞重编程技术从终末分化的成体细胞得到，因此可获得患者特异性或疾病特异性的iPSCs，促使其成为研究疾病发生机制、个体化药物治疗、药物筛选和细胞治疗的热点，进一步拉近了干细胞和临床疾病治疗的距离。iPSCs在长期培养过程中容易发生分化和核型不稳定情况，在长期培养过程中维持iPSCs正常不分化状态和自我更新能力是一项极具挑战性的工作。而长期培养在饲养层体系中是维持iPSCs不分化状态和核型稳定最简单、直接和有效的方法，因此制备高质量的Feeder成为培养iPSCs的关键技术。目前，Feeder制备方法主要有γ-射线照射法和丝裂霉素（MitomycinC，MMC）处理法：γ射线法的优点是可大批量处理细胞，但是由于γ射线存在放射性污染及储存监管程序繁琐，费用昂贵等缺点，世界上很多地区已找不到放射源，因此多数实验研究仍采用MMC法来制备Feeder。小鼠胚胎成纤维细胞（mouseembryonicfibroblasts，MEFs），是最常用的Feeder细胞来源；而CF-1MEFs是培养人iPSCs（hiPSCs）最常用的Feeder细胞来源，具有增殖能力极强、可覆层生长、密度依赖性高、低密度时易发生老化等特点。传统MMC法制备CF-1MEFFeeder时，通常需要将MEFs以较低密度铺至细胞培养皿/瓶中，待其长至≤100%融合（保证细胞为单层存在）时，用MMC抑制其有丝分裂，存在以下问题：1)产量低，成本高：利用传统方法单个细胞培养皿/瓶处理的细胞数量较少，要想得到足够数量的Feeder就需要消耗大量的实验耗材，多批量处理必然产生昂贵的费用；2）细胞增殖抑制不充分：若提高单个细胞培养皿/瓶处理细胞的密度，会出现细胞增殖不能被充分抑制的问题；3)MEFs的生物学行为易受影响：由于CF-1MEFs低密度时易发生老化，分泌hiPSCs必需营养因子的能力就会下降，可能影响到hiPSCs的生长状态；4）处理时间受限：为了充分抑制细胞增殖，最好在细胞生长至80%~90%融合时用MMC处理，但CF-1MEFs增殖速度很快，易出现覆层生长从而错过最佳处理时机。为了降低Feeder的制备成本，提高细胞处理效率，降低操作者工作强度，急需一种新方法，既可以单批处理大量细胞，又能保证细胞增殖被充分抑制。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种利用搅拌式细胞培养转瓶机快速制备Feeder细胞的方法，以搅拌式细胞培养转瓶机作为细胞处理设备，搅拌锤可在电磁场作用下不断旋转，使细胞在悬浮状态下与培养液中的MMC充分接触，可提高MMC抑制细胞增殖的效率，缩短处理时间；悬浮状态下处理细胞，回收细胞时无需消化液消化，可减少消化对细胞带来的损伤，最大限度地保持细胞的良好状态；细胞培养瓶的容积是普通培养瓶/皿的几倍甚至上百倍，短时间内可处理大量细胞，可提高Feeder的制备效率，降低Feeder的制备成本，操作更为灵活方便。为了达到上述目的，本专利技术采用的技术方案如下：一种利用搅拌式细胞培养转瓶机快速制备Feeder细胞的方法，包括CF-1MEFs原代获取、CF-1MEFs传代培养和CF-1MEFFeeder制备等三个步骤，其特征在于，制备CF-1MEFFeeder以搅拌式细胞培养转瓶机作为细胞处理设备，具体包括以下步骤：（1）CF-1MEFs原代(P0)获取：I、取孕12.5天的CF-1小鼠，脱颈处死、无菌条件下取出胚胎，用10mlPBS（即磷酸盐缓冲液）清洗后放于无菌培养皿中；去除胚胎头部和内脏，用10mlPBS清洗2次；II、将剩余组织移至新的无菌培养皿中，用无菌剪刀将组织剪碎，每个胚胎加入1ml消化液，同时吹打数次，放入培养箱中消化5min；加入与消化液等体积的培养液终止消化后充分吹打尽量分散为单细胞；III、将上述细胞悬液混匀后，每个T75培养瓶添加2个胚胎的细胞悬液和13ml培养液，然后将培养瓶放到培养箱中培养，培养瓶上注明细胞名称、代次P0及日期。（2）CF-1MEFs传代培养：①、P0代CF-1MEFs培养3天后，倒置显微镜下观察MEFs长满培养瓶底时，吸弃培养液，用10mlPBS清洗细胞一遍，然后加入2ml消化液将其混至覆盖整个培养瓶底部；②、培养瓶置于培养箱中孵育3分钟，用手轻拍培养瓶侧壁使MEFs细胞脱落；用2ml培养液终止消化，同时轻轻吹打形成单细胞悬液；③、将上述细胞悬液均分到3个T75瓶中（即为1:3传代培养），用培养液补至15ml进行传代，放入培养箱中继续培养；、用此方法，将细胞传至第3代。（3）、CF-1MEFFeeder制备：A：将搅拌式细胞培养转瓶机的磁力搅拌器消毒后置于培养箱内，磁力搅拌器通过控制线与培养箱外的控制箱相连；转瓶机的专用细胞培养瓶和搅拌锤高温、高压灭菌后冷却至室温待用；B、CF-1MEFs培养至第3代第4天后，吸弃培养液，用10mlPBS清洗细胞一遍，然后加入2ml消化液于培养箱中消化3分钟，用手轻拍培养瓶侧壁使细胞脱落，添加2ml培养液终止消化，将细胞收集到同一个离心管中后计数；C、将步骤B中收集的细胞转移到专用细胞培养瓶中，依据细胞数添加培养液至25~1000ml，将细胞密度调整至0.5×106~1.3×106个/ml；然后避光条件下将MMC加至上述培养液中，将MMC浓度调整至10µg/ml，充分混匀后旋紧瓶盖；D、立即将专用细胞培养瓶置于培养箱内的磁力搅拌器上，旋松瓶盖，将控制箱上转动模式设置为10~20转/分钟，连续旋转0.5~2小时；本专利技术专用细胞培养瓶的盖子悬松，既可以保证细胞的无菌培养条件，又可满足细胞生存必须的氧气需求，同时培养箱内的CO2也可以进入到培养瓶中调节内部培养液的pH；E、旋转结束后，立即将细胞转移至50ml离心管内，放入离心机中以1000转/分钟的速度离心5~15分钟，然后吸弃离心管中上清液，去除含MMC的培养液；F、用PBS重悬细胞，将细胞密度调整到2×105~5×105个/ml，以1000转/分钟离心5~15分钟，离心结束后，吸弃上清液；G、按步骤F所述方法重复3次，得到需要的细胞，细胞计数后，冻存备用。优选的，步骤A中所述的搅拌式细胞培养转瓶机，为CellSpin比欧细胞培养转瓶机-搅拌式-4瓶位。优选的，步骤C中，细胞密度调整至0.6×106~1×106个/ml；步骤F中，细胞密度调整至3×105~4×105个/ml。优选的，步骤D中，将控制箱上转动模式设置为15转/分钟，连续旋转0.5~1.5小时；步骤E中，以1000转/分钟的速度离心10分钟，尽可能减少因离心而引起的细胞丢失，同时可避免因离心时间过长和/或转速过大影响细胞状态。优选的，步骤G中，冻存液配方各成分体积比为培养液：胎牛血清（FBS）：二甲基亚砜（DMSO）=9:10:1。优选的，本专利技术所述的培养液为：以本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种利用搅拌式细胞培养转瓶机快速制备Feeder细胞的方法，包括CF‑1 MEFs原代获取、CF‑1 MEFs传代培养和CF‑1 MEF Feeder制备三个步骤，其特征在于，制备CF‑1 MEF Feeder时以搅拌式细胞培养转瓶机作为细胞处理设备，转瓶机的旋转锤在电磁场作用下不断旋转，从而使细胞在悬浮状态下与培养液中的MMC充分接触；悬浮状态处理细胞，回收细胞时无需消化液处理，减少消化对细胞带来的损伤。

【技术特征摘要】
1.一种利用搅拌式细胞培养转瓶机快速制备Feeder细胞的方法，包括CF-1MEFs原代获取、CF-1MEFs传代培养和CF-1MEFFeeder制备三个步骤，其特征在于，制备CF-1MEFFeeder时以搅拌式细胞培养转瓶机作为细胞处理设备，转瓶机的旋转锤在电磁场作用下不断旋转，从而使细胞在悬浮状态下与培养液中的MMC充分接触；悬浮状态处理细胞，回收细胞时无需消化液处理，减少消化对细胞带来的损伤；转瓶机的旋转锤在电磁场作用下不断旋转，其旋转速度为10~20转/分钟，连续旋转0.5~2小时。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，回收细胞无需消化液处理指的是，在悬浮状态下处理细胞，处理结束后，细胞可直接离心后吸弃上清液，然后用PBS重悬细胞沉淀后清洗，不经过消化液消化过程。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，制备CF-1MEFFeeder的具体步骤为：A：将搅拌式细胞培养转瓶机的磁力搅拌器消毒后置于培养箱内，磁力搅拌器通过控制线与培养箱外的控制箱相连；转瓶机的专用细胞培养瓶和搅拌锤高温、高压灭菌后冷却至室温待用；B、CF-1MEFs培养至第3代第4天后，加入2ml消化液于培养箱中消化3分钟，用手轻拍培养瓶侧壁使细胞脱落，然后用2ml培养液终止消化，将细胞收集到同一个离心管中后计数；C、将步骤B中收集的细胞转移到专用细胞培养瓶中，依据细胞数添加培养液至25~1000ml，将细胞密度调整至0.5×106~1.3×106个/ml；然后避光条件下将MMC加至上述培养液中，将MMC浓度调整至10µg/ml，充分混匀后旋紧...

【专利技术属性】
技术研发人员：李玉林，刘晋宇，战立香，池光范，张丽红，李莉莎，
申请(专利权)人：吉林大学，
类型：发明
国别省市：吉林;22