支原体核酸恒温扩增方法技术

本发明专利技术公开了一种支原体核酸恒温扩增方法，具体地，本发明专利技术方法包括步骤：在反应体系中进行扩增，所述的反应体系中含有扩增支原体的特异性引物对，所述引物可以从极低支原体拷贝数的检测样品中扩增出对应于支原体特征性序列的扩增产物。本发明专利技术方法能够高特异性、高灵敏度、低污染、快速地对含有支原体RNA的待测样品进行扩增，尤其适用于对含有生殖支原体MG和/或肺炎支原体MP的待测样品进行扩增和检测，具有检测效率高，准确度高的特点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及微生物的生物检测
，具体涉及将特异性靶标捕获技术和实时 荧光核酸恒温扩增检测技术结合的支原体的实时荧光核酸恒温扩增检测中使用的引物、探 针及相关试剂盒。
技术介绍
支原体是一类介于细菌与病毒之间的原核细胞微生物，缺少细胞壁，能独立复制。 寄生于人和其他灵长类动物的泌尿生殖道中，依靠高度特异的寄生机制包括独特的顶端细 胞器移植并侵入到人类细胞。 近年来大量的流行病学资料提示，生殖支原体MG是人类泌尿生殖道的常见病原 体，与许多非淋球菌性尿道炎（NGU)、前列腺炎和盆腔炎等都有关系，是性传播疾病的病原 体之一。 目前，MG的主要检测方法有：培养法、免疫学方法和分子生物学方法等。分离培养 和血清学方法，繁杂费时，无法满足同时处理大量样本的需要。分子生物学方法需要经历几 十个温度变化的循环过程，扩增反应时间长，且产物为DNA，易污染，易受其他因素影响。因 此，开发一种快速、灵敏、特异且不易污染的试剂盒非常必要。 肺炎支原体（mycoplasmapneumoniae,MP)感染不仅引起肺部病变，且能侵入心、 脑、肝、肾等其他器官，引起多种肺外表现。由于感染常无特异性表现，容易与一般的病毒性 感冒相混淆。 目前，MP的实验室诊断方法有培养法、免疫学方法和分子生物学方法等。然而，传 统的MP分离培养需3周甚至更长时间；MP快速培养法是利用MP在选择性液体培养基中生 长，根据其代谢产物使培养基颜色发生改变的特点来判断MP是否生长，显著缩短了MP的培 养时间，一般实验室均可开展，但在判断时需要注意假阴性。 免疫学方法包括很多，其中冷凝集试验（cold agglutinin test, CAT)的敏感性及 特异性均不理想。富士明胶颗粒凝集法（polystyrene latex agglutination reaction, PLA)的灵敏度和特异性均提高，操作简单，价格便宜，无需特殊仪器设备，3小时能出报告， 适合临床常规检查。ELISA间接法用于检测血清中特异性的IgM和IgG抗体，但检测结果 受免疫系统状况的影响。 分子生物学主要为检测DNA的PCR法和检测RNA的恒温扩增检测法。PCR属于 一种核酸体外扩增技术，用寡核苷酸指导的DNA合成的重复循环来实现对靶核酸序列的扩 增。从理论上PCR可将最初的靶DNA扩增109倍。最后可用凝胶电泳或探针杂交检测扩增 的DNA。除了样本中的抑制物会影响PCR的敏感性，导致出现假阴性结果外，PCR的另外一 个缺点是由于其本身技术原理的原因，容易造成假阳性污染。 最新发展RNA恒温扩增技术的是Gen-Probe公司的转录介导扩增法（TMA)，其采用 化学发光法进行终点检测，在检测中，需要打开反应管进行灭活，在污染控制上稍显不足。 实时突光核酸恒温扩增检测技术（Simultaneous AMGlification and Testing， 简称SAT)是一种直接快速检测RNA的方法，与检测DNA的实时荧光PCR相比，不同之处， 前者检测体系多了一个逆转录反应的步骤，核酸扩增在一个温度下进行（42°C)，无需热循 环。采用M-MLV逆转录酶和I7RNA聚合酶进行核酸扩增，相对于其它核酸扩增技术，反应抑 制物更少，能有效减少假阴性结果。然而，SAT技术在不同种类病毒的检测中应用所面临的 问题各不相同，需要具体分析病毒的特性进行专门设计。目前尚无针对生殖支原体（MG)及 肺炎支原体（MP)的实时荧光核酸恒温扩增检测技术的研究报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种快速，高准确度，污染易控，设备简单，成本低的支原体 RNA检测方法。 本专利技术的第一方面，提供了一种支原体的扩增方法，所述扩增方法包括步骤：在 反应体系中进行扩增，所述的反应体系中含有扩增支原体的特异性引物对，所述引物对包 括： T7引物：序列如SEQIDN0:3所示；和 nT7引物：序列如SEQIDN0:4所示。 在另一优选例中，所述的支原体是生殖支原体MG和/或肺炎支原体MP。 在另一优选例中，所述反应体系中还包括M-MLV反转录酶和I7RNA聚合酶。 在另一优选例中，所述反应体系还包括待测支原体的特异性捕获探针。 在另一优选例中，所述的待测支原体是生殖支原体MG和/或肺炎支原体MP。 在另一优选例中，所述反应体系还包括待测支原体的特异性检测探针。 在另一优选例中，所述的捕获探针的一端标记荧光基团，另一端标记淬灭基团。 在另一优选例中，所述的检测探针的5'端标记FAM荧光基团，且检测探针的3'端 标记DABCYL淬灭基团。 在另一优选例中，所述检测探针的核苷酸序列如SEQIDN0:5所示。 在另一优选例中，所述检测探针的核苷酸序列如SEQIDNO: 13所示。 在另一优选例中，所述的捕获探针可与生殖支原体MG的靶标核酸（MGRNA)序列 特异结合。 在另一优选例中，所述方法还包括：在另一对照反应体系中进行扩增反应。 在另一优选例中，所述的对照反应体系中含有所述特异性引物对、MG内标（MG1C RNA)、所述捕获探针和所述检测探针。 在另一优选例中，所述捕获探针的核苷酸序列如SEQIDN0:2所示。 在另一优选例中，所述的MG检测探针用于与在I7RNA聚合酶作用下根据所述MG 靶标核酸（MGRNA)的DNA拷贝产生的RNA拷贝特异结合。 在另一优选例中，所述的反应体系中生殖支原体MG或的拷贝数小于100个，较佳 地为1-50个拷贝，更佳地为1-10个拷贝。 在另一优选例中，所述的捕获探针可与肺炎支原体MP的靶标核酸（MPRNA)序列 特异结合。 在另一优选例中，所述方法还包括：在另一对照反应体系中进行扩增反应。 在另一优选例中，所述的对照反应体系中含有所述特异性引物对、MP内标（MP1C RNA)、所述MP捕获探针和所述MP检测探针。 在另一优选例中，所述捕获探针的核苷酸序列如SEQIDN0:2所示。 在另一优选例中，所述的MP检测探针用于与在I7RNA聚合酶作用下根据所述MP 靶标核酸（MPRNA)的DNA拷贝产生的RNA拷贝特异结合。 在另一优选例中，所述的反应体系中肺炎支原体MP或的拷贝数小于100个，较佳 地为1-50个拷贝，更佳地为1-10个拷贝。 在另一优选例中，所述方法还包括步骤：在扩增反应过程之中或之后，检测待测支 原体的特异性探针发出的荧光信号。 在另一优选例中，所述方法为实时荧光核酸恒温扩增法。 在另一优选例中，所述反应体系中还含有待测的生殖支原体或衍生自所述生殖支 原体核酸。 在另一优选例中，所述的待测核酸是来自环境样品或人类泌尿生殖道分泌物的核 酸。 在另一优选例中，所述的待测核酸是来自环境样本或人类泌尿生殖道或呼吸道 分泌物的核酸。 本专利技术的第二方面，提供了一种支原体的非诊断性检测方法，所述检测方法包 括： 用如本专利技术第一方面中所述的扩增方法扩增待测样品；和 在扩增反应过程之中或之后，检测待测支原体的特异性探针发出的荧光信号。 在另一优选例中，所述方法还包括设置一个或多个对照组。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种支原体的扩增方法，其特征在于，所述扩增方法包括步骤：在反应体系中进行扩增，所述的反应体系中含有扩增支原体的特异性引物对，所述引物对包括：T7引物：序列如SEQ ID NO:3所示；和nT7引物：序列如SEQ ID NO:4所示。

【技术特征摘要】
1. 一种支原体的扩增方法，其特征在于，所述扩增方法包括步骤：在反应体系中进行 扩增，所述的反应体系中含有扩增支原体的特异性引物对，所述引物对包括： 17引物：序列如SEQ ID NO:3所示；和 n!7引物：序列如SEQ ID N0:4所示。2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述反应体系还包括待测支原体的特异性 捕获探针。3. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述反应体系还包括待测支原体的特异性 检测探针。4. 如权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于，所述方法还包括步骤：在扩增反应 过程之中或之后，检测待测支原体的特异性探针发出的荧光信号。5. -种支原体的非诊断性检测方法，其特征在于，所述检测方法包括： 用如权利要求1中所述的扩增方法扩增待测样品；和 在扩增反应过程之中或之后，检测待测支原体的特异性探针发出的荧光信号。6. -种支原体的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括： (a) 第一容器，以及位于所述容器内的扩增生殖支原体的特异性引物对，所述引物对包括： 17引物：序列如SEQ ID NO:3所示；和 n!7引物：序列如SEQ ID N0:4所示； 以及使用说明书。7. 如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，还含有选自下组的一种或多种组分： (b) 捕获...

【专利技术属性】
技术研发人员：王敏，马道亮，汤嘉维，于明辉，居金良，
申请(专利权)人：上海仁度生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31