链球菌溶血素O的突变形式制造技术

无毒但仍保留诱导抗酿脓链球菌感染的能力的GAS25(链球菌溶血素O)可用于疫苗组合物以诱导抗酿脓链球菌感染。本发明专利技术具体涉及纯化的突变型链球菌溶血素O(SLO)蛋白，其在氨基酸位置A248包含氨基酸改变，其中所述氨基酸的位置按SEQ ID NO:1编号，且其中所述突变型SLO蛋白的溶血活性相比野生型SLO降低至少50％。

【技术实现步骤摘要】
链球菌溶血素 O的突变形式 本专利技术专利申请是国际申请号为PCT//IB2008/003725,国际申请日为2008年12 月18日，进入中国国家阶段的申请号为200880126781. 1，名称为链球菌溶血素0的突变 形式的专利技术专利申请的分案申请。 本申请要求2007年12月21日提交的US61/016193和2008年8月13日提交的 US61/088381的优先权，其内容通过引用纳入本文。 专利
本专利技术涉及免疫学和疫苗学领域。 专利技术背景 链球菌溶血素0(SL0 ;GAS25)是人病原体酿脓链球菌（Streptococcus pyogenes) (GAS)的一种最重要的致病因子。由于它能激发人的早期且强烈的免疫应答，因此通常用作 GAS感染的诊断标记物。 SLO属于高同源性巯基激活的溶细胞素（TACY)家族，该家族通过与细胞膜上的胆 固醇相互作用、自发寡聚化以及形成穿孔发挥其溶细胞活性。此外，它们能够结合人IgG的 Fc区从而直接激活经典补体途径，这可导致对宿主细胞的补体介导的直接攻击。TACY也通 过诱导细胞因子和炎性介质从而干扰宿主的防御和免疫细胞功能。 一些TACY可被动或主动保护试验动物。参见FEMS Lett. 182,197-205, 2000。然 而，这些毒素复杂的有害副作用模式将影响它们作为疫苗候选物的用途。也就是说，本领域 需要无毒的SLO蛋白。 附图简述 图I. SLO的三维计算机模型。脯氨酸表示为空间填充。Pr〇427为白色。 图2.该图显示了用含有野生型SLO和SLO突变型P427L的大肠杆菌提取物进行 的溶血试验的结果。 图3. SDS-聚丙烯酰胺凝胶的显微照片，显示了纯化的SLO突变型P427L。 图4.该图显示了用纯化的野生型SLO和SLO突变型P427L进行的溶血试验的结 果。 图5.大肠杆菌裂解上清液的SDS-聚丙烯酰胺凝胶的显微照片。泳道A，大肠杆菌 阴性对照；泳道B，rSL0野生型，无标签；泳道C，rSL0 P427L，无标签；和泳道D，纯化的rSLO 野生型，无标签（5mg)。 图6?该图证明，在相同条件下，SLO突变型P427L的溶血能力比野生型SLO低1000 倍。 图7.该图证明了胆固醇对野生型SLO和SLO突变型P427L溶血作用的影响。 图8.细胞提取物中所有无标签蛋白的SDS-PAGE分析的显微照片。图8A， SLO野生型和P427L无标签蛋白的表达；图8B，SLO P427L+W535、P427L+C530G、和 P427L+C530G+W535F无标签蛋白的表达。 图9.细胞提取物中所有带His标签的蛋白质的SDS-PAGE分析的显微照片。 图10.纯化的带His标签的蛋白质的SDS-PAGE分析的显微照片。 图11.纯化的无标签蛋白质的SDS-PAGE分析的显微照片。图11A， 泳道A，SLO野生型无标签蛋白；泳道B，SLO P427L无标签蛋白；分子量标记 (116-66. 2-45-35-25-18. 4-14. 4);黑色箭头表示从突变型和野生型克隆纯化的SLO蛋 白。图11B，泳道A，SLO野生型无标签蛋白（3iig);泳道B，SLO P427L-W535F无标签蛋白 (3 U g);分子量标记（116-66. 2-45-35-25-18.4-14.4);黑色箭头表示从突变型和野生型 克隆纯化的SLO蛋白。 图12.纯化的无标签SLO野生型蛋白的SDS-PAGE分析的显微照片。在还原和非 还原条件下分析野生型SLO不同纯化批次的样品。 图13.该图显示了带His标签的SLO突变体的溶血测试结果。 图14.该图显示了抗-SLO抗血清对SLO-诱导的溶血活性的抑制作用。 图15.该图显示了抗-SLO抗血清抑制SLO溶血作用的滴度。 图16?该图显示了 SLO溶血活性滴度。 图17.该图显示了野生型SL0、化学去毒的野生型SLO和SLO突变体（P427L; P427L+W535F)的溶血活性滴度。 图18.该图显示了野生型SLO和SLO突变体（P427L ;P427L+W535F)的溶血活性滴 度。 图19.该图显示了野生型SLO和化学去毒的野生型SLO的溶血活性滴度。 图20.该图显示了使SLO溶血活性（50ng/ml SL0)降低50 %所需的SLO突变体 P427L+W535F抗血清的稀释度。 图21.该图显示了使SLO溶血活性（lOOng/ml SL0)降低50%所需的SLO突变体 P427L+W535F抗血清的稀释度。 图22.滴定曲线，显示了用100%溶血毒素浓度进行的溶血抑制试验。 图 23. SLO 蛋白的比对。M1_SF370, SEQ ID N0:1 ;M12_2096, SEQ ID N0:2 ; M12_9429,SEQ ID NO:3 ；M1_5005, SEQ ID N0:4；M2,SEQ ID N0:5；M28,SEQ ID N0:6；M6,SEQ ID N0:7 ；M18, SEQ ID N0:8 ；M5, SEQ ID N0:9 ；M3, SEQ ID NO: 10 ；M3_SSI, SEQ ID NO: 11 ； 和 M4, SEQ ID NO:12。 图24.野生型SLO和带Hi s标签的SLO突变体的比对。SL0_M1株SF370 (SL0_ MlstrainSF370)，SEQ ID N0:13;SL0 野生型 _带1^8 标签（SL0 WT_histagged)，SEQ ID NO: 14 ;SL0 突变型? P427L_ 带 his 标签（SLOmut. P427L_histagged)，SEQ ID NO: 15 ;SL0 突 变型 乂5306_带1^8 标签（SL0mut.C530G_histagged)，SEQ ID N0:16;SL0 突变型? SA248_ 带 his 标签（SL0mut.DeltaA248_histagged)，SEQ ID N0:17 ;SL0 突变型.￥535?_带1118 标 签（SLOmut. W535F_histagged)，SEQ ID NO: 18 ;和 SLO 突变型? W535F&D482N_ 带 his 标签 (SL0mutff535F&D482N_histagged), SEQ ID NO:19. 图25.该图比较了野生型SLO抗血清和SLO突变体P427L+W535F抗血清造成的 ALO溶血活性的降低。 图26.该图显示了采用明矾或MF59作为佐剂的重组SLO突变体P427L+W535F的 体内保护特性。 专利技术详述 本专利技术提供无毒但仍保留了诱导抵御酿脓链球菌保护能力的链球菌溶血素0的 突变体（SL0;GAS25)。SLO的突变形式可用于疫苗组合物中诱导抗酿脓链球菌的保护力。 突变型SLO蛋白 通过溶血试验测得，本专利技术的SLO突变形式的溶血活性比野生型SLO低至少50% (例如低 50、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99 或 100% )，但具有免疫原性，例如 能赋予小鼠模型抵御GAS致死性攻击的保护力（例如见实施例7)。本专利技术的SLO突变体 包括 SLO 突变体 P427本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种纯化的突变型链球菌溶血素O(SLO)蛋白，其在氨基酸位置A248包含氨基酸改变，其中所述氨基酸的位置按SEQ ID NO:1编号，且其中所述突变型SLO蛋白的溶血活性相比野生型SLO降低至少50％。

【技术特征摘要】
2007.12.21 US 61/016,193;2008.08.13 US 61/088,3811. 一种纯化的突变型链球菌溶血素0(SLO)蛋白，其在氨基酸位置A248包含氨基酸改 变，其中所述氨基酸的位置按SEQ ID NO: 1编号，且其中所述突变型SL0蛋白的溶血活性相 比野生型SL0降低至少50%。2. 如权利要求1所述的纯化的突变型SL0蛋白，其还包含氨基酸位置C530的氨基酸改 变。3. 如权利要求1所述的纯化的突变型SL0蛋白，其中A248的氨基酸改变是缺失。4. 如权利要求2所述的纯化的突变型SL0蛋白，其中A248的氨基酸被亮氨酸取代， C530的氨基酸被甘氨酸取代。5. 如权利要求1所述的纯化的突变型SL0蛋白，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:23。6. 如权利要求1所述的纯化的突变型SLO蛋白，其特征在于，该蛋白偶联于载体蛋白。7. 如权利要求6所述的纯化的突变型SL0蛋白，其特征在于，所述载体蛋白选自：细菌 毒素、细菌类毒素、脑膜炎奈瑟球菌外膜蛋白、热激蛋白、百日咳蛋白、流感嗜血杆菌蛋白D、 细胞因子、淋巴因子、激素、生长因子、艰难梭菌毒素 A、艰难梭菌毒素 B和铁摄取蛋白。8. 编码权利要求1-5中任一项所述的突变型SL0蛋白的核酸分子。9. 如权利要求8所述的核酸分子，其包含核苷酸序列SEQ ID NO: 58。10. -种疫苗组合物，其包含： (a) 选自以下的活性剂： (i) 权利要求1-5中任一项定义的纯化的突变型链球菌溶血素 O(SLO)蛋白；和 (ii) 编码权利要求1-5中任一项定义的纯化的突变型链球菌溶血素 O(SLO)蛋白的核 酸分子；和 (b) 药学上可接受的运载体。11. 如权利要求10所述的疫苗组合物，其特征在于，该组合物还包含一种或多种选自 下组的活性剂： (a) GAS抗原；和 (b) 编码GAS抗原的核酸分子。12. 如权利要求10所述的疫苗组合物，其特征在于，该组合物还包含儿童疫苗所用的 活性剂。13. 如权利要求12所述的疫苗组合物，其特征在于，所述活性剂选自： (a) 选自以下的病原体的多肽抗原：脑膜炎奈瑟球菌、肺炎链球菌、百日咳博德特菌、 粘膜炎莫拉菌、破伤风梭菌、白喉棒状杆菌、呼吸道合胞病毒、脊髓灰质炎病毒、麻疹病毒、 腮腺炎病毒、风疹病毒和轮状病毒多肽抗原；和 (b) 编码所述多肽抗原的核酸分子。14. 如权利要求10所述的疫苗组合物，其特征在于，该组合物还包含用于老年人或免 疫力低下个体疫苗的第二种活性剂。15. 如权利要求14所述的疫苗组合物，其特征在于，所述第二种活性剂选自下组： (a) 选自以下的病原体的多肽抗原：粪肠球菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、铜绿 假单胞...

【专利技术属性】
技术研发人员：G·本斯，I·马格里特伊若斯，E·恰洛特，G·格兰迪，M·斯卡塞利，
申请(专利权)人：诺华股份有限公司，
类型：发明
国别省市：瑞士;CH