突变体肺炎链球菌溶血素蛋白质制造技术

本发明专利技术涉及包含突变体肺炎链球菌肺炎链球菌溶血素蛋白质的免疫原性组合物。本发明专利技术进一步涉及所述蛋白质和编码这些蛋白质的核酸。在具体的实施方案中，本发明专利技术涉及分离的突变体肺炎链球菌溶血素（ＰＬＹ）蛋白质，其中该突变体ＰＬＹ蛋白质通过在野生型序列的氨基酸１４４至１６１区域内存在突变而不同于野生型ＰＬＹ蛋白质，使得突变体的毒性相对于野生型蛋白质的毒性而言降低。在具体的实施方案中，该突变体ＰＬＹ蛋白质通过在该区域内氨基酸的替代或缺失，包括野生型序列的氨基酸１４４至１５１区域内两个相邻氨基酸的缺失，而不同于野生型蛋白质。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及包括突变体肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)肺炎链球菌溶血素蛋白质的免疫原性组合物。本专利技术进一步涉及所述蛋白质和编码这些蛋白质的核酸。
技术介绍
肺炎链球菌为引起侵袭性疾病如肺炎、脑膜炎和菌血症的重要病原体。甚至在可自由获得有效抗生素疗法的地区，住院患者中肺炎球菌性肺炎的死亡率可高达19％。发展中国家中，每年超过3百万5岁以下的儿童死于肺炎，其中肺炎链球菌为最常见的病原体。肺炎链球菌还引起不太严重，但非常普遍的感染如中耳炎和鼻旁窦炎，其对发达国家中的健康-护理费用具有显著的影响。中耳炎在幼童中尤其重要，而鼻旁窦炎感染儿童和成人。来自Wyeth的七价多糖缀合物疫苗，在美国作为Prevnar销售而在世界上其他国家作为Prevenar销售，为目前有效预防肺炎链球菌感染的唯一有效的缀合物疫苗(Kyaw等.，2002；Hausdorff等.，2000)。该疫苗包括可能的90种中七种纯化的链球菌荚膜多糖(血清型4、6B、9V、14、18C、19F和23F)(Kalin，1998)，每种都缀合至载体蛋白。所述疫苗的制备在美国专利4,673,574中描述(Anderson)。用于缀合荚膜多糖的蛋白质为白喉类毒素CRM197，它提供婴儿中该疫苗免疫原性的增强(Blum等.，2000；Katkocin，2000)。然而，每种肺炎链球菌血清型具有结构不同的荚膜多糖，使得用一种血清型进行的免疫趋向于不提供对大部分其他血清型的预防，虽然对疫苗相关的血清型存在一些交叉预防(Whitney等.，2003)。血清型-特异性免疫的补充方法正在研究中。一种可能性为还利用物种共有的毒力因子如肺炎链球菌溶血素(Pneumolysin，PLY)，这是由所有肺炎链球菌的侵袭性株产生的53kD毒素(Paton等.，1993)。PLY可单独使用或作为缀合至Prevnar中多糖的载体蛋白使用，提供增强的效力。Alexander等(1994)证实小鼠用PLY类毒素的免疫赋予对用9种不同肺炎链球菌血清型攻击的免疫保护。已显示PLY通过激活经典的补体途径(Paton等.，1984)以及诱导嗜中性粒细胞和巨噬细胞凋亡(Cockeran等.，2002；Kadioglu等.，2000)而刺激类似于肺炎链球菌感染的免疫应答。PLY属于胆固醇结合性溶细胞素(CBC)组，其在形成产生溶解孔的大的30-50mer环状结构之前结合至宿主细胞膜的胆固醇(Palmer，2001；Jedrzejas，2001)。孔形成的机制不完全了解并且对事件的顺序存在许多争论(Boney等.，2000；Shepard等.，1998)。然而，形成孔的能力意味着天然的PLY为高毒性的，这对免疫原性组合物开发是一个问题。虽然生产中所用的缀合方法使得PLY无毒，更好的是以无毒形式开始。此外，有毒形式将难以用于非缀合免疫原性组合物的制备。PLY的毒性可通过定点诱变显著降低以产生PLY类毒素，称为Pneumolysoids(Paton，1996)。存在各种这类类毒素并且已显示其独立或在缀合至多糖时给小鼠对有毒力的2型D39肺炎链球菌攻击提供免疫保护(Paton等.，1991；Alexander等.，1994)。之前大多数突变在接近C′末端的高度保守的11个氨基酸区域中产生(Mitchell等.，1992；Berry等.，1995)。已显示该位点参与结合宿主细胞(de los Toyos等.，1996)。国际专利申请WO 90/06951中描述了PLY许多这类突变形式；该出版物中描述的每一突变接近蛋白质的C′末端。PLY另外的问题为其在大规模生产时聚集，这是PLY用于免疫原性组合物中必须解决的问题。据信PLY的聚集与参与孔形成的PLY的寡聚化有关。本专利技术因此试图降低或消除PLY-PLY的相互作用(寡聚化)，使得降低大规模生产期间的聚集可能性，由此产生PLY很容易纯化的形式。Toyos等(1996)描述了PLY不同区域单克隆抗体(mAb)的形成以及完整毒素和‘蛋白酶K切口’形式的探测。蛋白酶K切割PLY成37kD和15kD的片段。抗体mAb PLY 4仅识别完整的PLY，而不识别这些片段，表明针对该mAb的PLY上的表位位于切口区域内。当PLY与mAb PLY 4预温育，随后添加至脂质体中时，该毒素不再在脂质体膜上形成孔。这暗示mAb PLY 4封闭的位点(认为为天冬酰胺N143区域)为负责与其他PLY单体相互作用以形成寡聚体孔的位点。如Hugo等1986证实的，链球菌属的链球菌溶血素O的寡聚化也可由mAb阻断。是否抗体通过结合至寡聚化位点而直接阻止寡聚化或是否存在空间阻碍毒素单体相互作用的关联是未知的。单克隆抗体PLY 4已由Suarez-Alvarez等(2003)进一步表征并且提示mAb PLY 4的表位比最初Toyos等在1996提议的N143区域更下游。目前看来识别位点是构象依赖性的并且在氨基酸E151-Y247内而非N143区域内。之前本专利技术人建立了PLY内的N142N143缺失和N143D替代作为了解该区域以及其在寡聚化中的作用的第一步。两种突变体在溶血作用和孔形成(Search，2002)方面显示与天然PLY相同的行为，提示未阻断寡聚化，以及突变体的毒性维持不变。因此，之前产生的突变体PLY形式不显示降低的毒性或降低的寡聚化，提示这些突变无助于免疫原性组合物的生产。专利技术概要本专利技术广泛涉及包括突变体肺炎链球菌肺炎链球菌溶血素蛋白质的免疫原性组合物。本专利技术进一步涉及所述蛋白质和编码这些蛋白质的核酸。因此在一个方面，本专利技术涉及分离的突变体肺炎链球菌溶血素(PLY)蛋白质，其中该突变体PLY蛋白质通过在野生型序列的氨基酸144至161区域内存在突变而不同于野生型PLY蛋白质，使得该突变体的毒性相对野生型蛋白质的毒性而言降低。该突变可位于野生型序列的氨基酸144至151的区域内。该突变可以是在野生型序列的氨基酸144至161区域内一个或多个氨基酸的缺失或替代。该突变体PLY蛋白质可通过在野生型序列的氨基酸144至151区域内一个或多个氨基酸的替代或缺失而不同于野生型蛋白质。例如，该突变体PLY蛋白质可通过在野生型序列的氨基酸144至151区域内两个相邻氨基酸的替代或缺失而不同于野生型蛋白质，例如氨基酸缬氨酸144和脯氨酸145、丙氨酸146和精氨酸147、甲硫氨酸148和谷氨酰胺149或酪氨酸150和谷氨酸151的缺失。任何上述突变体PLY蛋白质可进一步包括在野生型序列的氨基酸257-297、367-397或424-437至少一个区域中至少一个氨基酸替代或缺失。分离的突变体PLY蛋白质具有对哺乳动物降低的毒性。此典型地为与野生型PLY蛋白质相比具有降低的成孔活性的结果，其可与降低的溶血活性和/或降低的寡聚化活性有关。希望的但不是必须的是，该突变体PLY蛋白质具有降低的寡聚化活性以利于纯化和随后的操作。在另外的方面，本专利技术涉及免疫原性缀合物(conjugate)，其包括(a)糖、低聚糖、多糖、肽、多肽或蛋白质；和(b)分离的突变体肺炎链球菌溶血素(PLY)蛋白质，其中该突变体PLY蛋白质通过在野生型序列的氨基酸144至161区域内存在突变而本文档来自技高网...

【技术保护点】
分离的突变体肺炎链球菌溶血素（ＰＬＹ）蛋白质，其中该突变体ＰＬＹ蛋白质通过在野生型序列的氨基酸１４４至１６１区域内存在突变而不同于野生型ＰＬＹ蛋白质，使得突变体的毒性相对于野生型蛋白质的毒性而言降低。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：利安柯卡姆，蒂莫西约翰米切尔，
申请(专利权)人：利安柯卡姆，蒂莫西约翰米切尔，
类型：发明
国别省市：GB[英国]