一种沃尼妙林卵黄抗体的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种沃尼妙林卵黄抗体的制备方法。本发明专利技术公开一种制备沃尼妙林卵黄抗体的方法，包括如下步骤：通过碳二亚胺将盐酸沃尼妙林与载体蛋白进行偶联，得到免疫原；用免疫原免疫蛋鸡，得到免疫蛋鸡的鸡卵；提取鸡卵卵黄中的沃尼妙林卵黄抗体。利用本发明专利技术公开的方法制备沃尼妙林抗体具有制备过程简单、经济，产量高等独特优点，在兽药残留检测中具有良好的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了。本专利技术公开一种制备沃尼妙林卵黄抗体的方法，包括如下步骤：通过碳二亚胺将盐酸沃尼妙林与载体蛋白进行偶联，得到免疫原；用免疫原免疫蛋鸡，得到免疫蛋鸡的鸡卵；提取鸡卵卵黄中的沃尼妙林卵黄抗体。利用本专利技术公开的方法制备沃尼妙林抗体具有制备过程简单、经济，产量高等独特优点，在兽药残留检测中具有良好的应用前景。【专利说明】
本专利技术涉及一种沃尼妙林抗体的制备方法；特别涉及一种沃尼妙林卵黄抗体的制 备方法，属于抗体制备领域。
技术介绍
沃尼妙林（Valnemulin，VAL)为新一代截短侧耳类（Pleuromutilin)半合成抗生 素，具有安全性较高、抗菌谱广、抗菌活性强、耐药性低等特点而受到广泛关注，目前该药主 要用于畜禽支原体及肠道螺旋体感染的预防与治疗。但是由于应用比较广泛，其在动物组 织内的残留现象较为严重，可能会引起一些不良反应，此外，沃尼妙林还可以与聚醚类药物 作用导致动物中毒。因此，欧洲医药评价局（EMEA)规定，沃尼妙林在猪组织中的最大残留 限量（MRL):肌肉，50 iig/kg;肝脏，500 iig/kg;肾脏，IOOii g/kg。 卵黄抗体（Egg yolk antibody)是从免疫禽蛋卵黄中提取的特异性抗体，为禽类 所特有，其化学性质稳定，生产制备过程简单、经济，产量高，适合大规模生产。制备卵黄抗 体时无需对动物进行采血，便于采集，不会对动物造成损伤，符合现代动物保护要求。但是 目前卵黄抗体在兽药残留检测领域应用较少，并且未见沃尼妙林卵黄抗体制备的报道。 【专利技术内容】 本专利技术的目的是提供。 本专利技术提供一种制备沃尼妙林卵黄抗体的方法，包括如下步骤：通过碳二亚胺将 盐酸沃尼妙林与载体蛋白进行偶联，得到免疫原；用免疫原免疫蛋鸡，得到免疫蛋鸡的鸡 卵；提取鸡卵卵黄中的沃尼妙林卵黄抗体。 上述方法中，所述载体蛋白为牛血清白蛋白。 上述任一所述的方法中，所述用免疫原免疫蛋鸡的方法如下：将所述免疫原用等 体积的弗氏完全佐剂乳化后首次免疫蛋鸡，再将首次免疫中所用的免疫原剂量减半，并用 等体积的弗氏不完全佐剂乳化后对首次免疫的蛋鸡进行加强免疫。 上述任一所述的方法中，所述免疫的方式为背部多点免疫。 上述任一所述的方法中，所述免疫原用PBS溶液溶解； 所述PBS溶液的浓度具体为0? 01mol/L。 上述任一所述的方法中，所述首次免疫的所述免疫原的剂量为300-400ug ; 所述加强免疫的次数为7-8次，具体为7次； 所述加强免疫具体为在首次免疫后第15天、29天、43天、55天、79天、91天以及 121天各进行一次加强免疫。 上述任一所述的方法中，所述提取鸡卵卵黄中的沃尼妙林卵黄抗体的方法为饱和 硫酸铵沉淀法，步骤如下： 1)将免疫蛋鸡的鸡卵中的卵黄与纯水混匀，调节pH至5. 0-5. 2,放置，得溶液1 ; 2)将溶液1离心，收集上清，加入pH7. 2-7. 4的饱和（NH4) 2S04水溶液，使饱和 (NH4) 2S04水溶液的体积占总体积的30-40%，放置，得溶液2 ; 3)将溶液2离心，取沉淀即得。 上述任一所述的方法中，所述卵黄和所述纯水的体积比为1:5-6,具体为1:6 ; 所述放置的条件为4°C -KTC放置12-20h，具体为4°C放置12-20h ; 所述饱和（NH4) 2S04水溶液占总体积的体积百分含量为40% ; 所述调节pH至5. 0-5. 2所用的试剂为盐酸。 由上述任一所述的方法制备得到的沃尼妙林抗体也属于本专利技术的保护范围。 上述沃尼妙林抗体在制备具有结合沃尼妙林的活性的产品中的应用也属于本发 明的保护范围； 或， 上述沃尼妙林抗体在制备检测沃尼妙林的产品中的应用也属于本专利技术的保护范 围。 本专利技术的有益效果在于，利用本专利技术提供的方法制备的沃尼妙林抗体产量高，在 整个试验周期（43周）内收集卵黄抗体的量大约为20g。在免疫后前10周，抗体效价上升 速度较快，然后慢慢趋向稳定，抗体效价可在一个较高的水平维持15周以上，并且抗体的 最高效价达1 :218。抗体灵敏度较高，随着免疫的进行，各抗体灵敏度不断提高，所制标准 曲线的IC5tl逐渐下降，并且最低可降至21. 77ng/mL。抗体特异性良好，除与泰妙菌素存在 383. 9%的交叉反应率外，与其它结构相似的抗生素类药物均不存在显著的交叉反应。 利用本专利技术提供的方法制备沃尼妙林抗体具有制备过程简单、经济，产量高等独 特优点，在兽药残留检测中具有良好的应用前景。 【专利附图】【附图说明】 图1为沃尼妙林免疫原结构图。 图2为沃尼妙林卵黄抗体效价变化趋势图。 图3为沃尼妙林卵黄抗体灵敏度变化趋势图。 【具体实施方式】 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。 盐酸沃尼妙林标准品购自欧洲药典委员会BP907-F67029，产品目录号为 Y0000584。 泰妙菌素标准品购自欧洲药典委员会BP907-F67029。 红霉素和阿维菌素标准品均购自梯希爱（上海）化成工业发展有限公司。 替米考星和泰乐菌素标准品均购自中国兽药监察所。 弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂均购自Sigma公司，产品目录号分别为F-5881和 F-5506。 蛋鸡购自北京市西苑农贸市场 Proclin 300生物防腐剂购自sigma公司 〇? 05M的碳酸盐缓冲液（pH9. 6)的组成成分及含量为： 【权利要求】1. 一种制备沃尼妙林卵黄抗体的方法，包括如下步骤：通过碳二亚胺将盐酸沃尼妙林 与载体蛋白进行偶联，得到免疫原；用免疫原免疫蛋鸡，得到免疫蛋鸡的鸡卵；提取鸡卵卵 黄中的沃尼妙林卵黄抗体。2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述载体蛋白为牛血清白蛋白。3. 根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述用免疫原免疫蛋鸡的方法如下： 将所述免疫原用等体积的弗氏完全佐剂乳化后首次免疫蛋鸡，再将首次免疫中所用的免疫 原剂量减半，并用等体积的弗氏不完全佐剂乳化后对首次免疫的蛋鸡进行加强免疫。4. 根据权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于：所述免疫的方式为背部多点免疫。5. 根据权利要求1-4任一所述的方法，其特征在于：所述免疫原用PBS溶液溶解； 所述PBS溶液的浓度具体为0. Olmol/L。6. 根据权利要求1-5任一所述的方法，其特征在于：所述首次免疫的所述免疫原的剂 量为 300-400ug ; 所述加强免疫的次数为7-8次，具体为7次。7. 根据权利要求1-6任一所述的方法，其特征在于：所述提取鸡卵卵黄中的沃尼妙林 卵黄抗体的方法为饱和硫酸铵沉淀法，步骤如下： 1) 将免疫蛋鸡的鸡卵中的卵黄与纯水混匀，调节pH至5. 0-5. 2,放置，得溶液1 ; 2) 将溶液1离心，收集上清，加入pH 7. 2-7. 4的饱和（NH4) 2S04水溶液，使饱和 (NH4) 2S04水溶液的体积占总体积的30-40%，放置，得溶液2 ; 3) 将溶本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种制备沃尼妙林卵黄抗体的方法，包括如下步骤：通过碳二亚胺将盐酸沃尼妙林与载体蛋白进行偶联，得到免疫原；用免疫原免疫蛋鸡，得到免疫蛋鸡的鸡卵；提取鸡卵卵黄中的沃尼妙林卵黄抗体。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王战辉，沈建忠，史为民，张素霞，江海洋，温凯，张会艳，盛雅洁，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：北京;11