本发明专利技术公开了一种优化百合胚性愈伤组织玻璃化超低温保存效果的方法，为采用含有碳纳米材料的玻璃化溶液处理百合胚性愈伤组织以提高其保存效果，具体包括：预培养、装载液处理、玻璃化溶液处理和液氮保存步骤，其中所述玻璃化溶液含有0.1~0.5g/L石墨烯量子点。本发明专利技术中公开的方法对百合胚性愈伤组织的保存效果优化显著，通过添加石墨烯量子点作为外源物质对植物玻璃化超低温保存起到促进作用。
【技术实现步骤摘要】
一种优化百合胚性愈伤组织玻璃化超低温保存效果的方法
本专利技术涉及植物或其局部的保存领域，具体涉及一种优化百合胚性愈伤组织玻璃 化超低温保存效果的方法。
技术介绍
超低温保存是上世纪70年代发展起来的一项现代种质资源离体保存技术。通常 在液氮中保存，被保存材料细胞内的物质代谢和生长活动几乎完全停止，处在相对稳定的 生物学状态，达到长期保存种质的目的，超低温保存是目前唯一不需要连续继代的中长期 保存方式。玻璃化法超低温保存是将细胞或组织置于由一定比例的渗透性和非渗透性保护 剂组成的玻璃化溶液中，使材料及其玻璃化溶液在足够快的降温速率下固化成非结晶的玻 璃化态，并以这种玻璃态在低温下保存。玻璃化法因操作简单快捷，成本低，适宜保存种类 广泛，保存材料遗传性稳定，保存效果好等优点，是近十年来用于优良种质资源中长期保存 的首选方法。 百合是百合科百合属的草本植物，为世界著名的球根花卉，具有花色丰富、姿态优 美的特色。百合被广泛运用在园林布景、切花、鲜花和盆栽观赏等方面。中国作为百合分布 中心，种质资源丰富，但多数野生种仍属于濒危植物。百合作为多年生球茎草本，不能通过 低温种子库进行保存，目前主要的保存方式为田间种植保存，易在保存过程中出现褐变、腐 烂，百合的中长期保存问题亟待解决。 国外关于百合的超低温研究开始于上世纪90年代，利用百合茎尖为外植体，通过 超低温保存的成活率仅为8. 45%，随着对超低温体系的不断改进，在玻璃化溶液PVS2出现 后，成活率显著提升，开始被应用于不同类型的材料。国内的相关研究起步较晚，已初步摸 索出百合超低温保存各关键步骤的保存条件，丰富了百合超低温保存体系。但关于百合胚 性愈伤组织作为材料进行超低温保存的研究还很少，还未建立百合胚性愈伤组织的超低温 保存体系。因此建立百合胚性愈伤组织超低温保存体系并加以优化，提高百合胚性愈伤组 织冻后存活率，对百合的研究与产业发展具有很重要的作用。
技术实现思路
鉴于以上所述现有技术的缺点，本专利技术的目的在于提供一种新的提高百合胚性愈 伤组织保存效果的方法，以克服现有技术中植物及其组织中长期保存难以实现，以及超低 温保存的植物或其组织恢复生长率低的缺点。 为了实现上述目的或者其他目的，本专利技术是通过以下技术方案实现的。 一种提高百合胚性愈伤组织保存效果的方法，采用玻璃化法超低温保存的方法对 百合胚性愈伤组织进行保存，具体步骤如下： 1)预培养：将百合胚性愈伤组织置于预培养基上，在0?KTC下预培养1?4天； 2)装载液处理：室温下，将百合胚性愈伤组织在装载液中浸泡处理40?60分钟 后移除装载液； 3)玻璃化溶液处理：在0?25°C下使用玻璃化溶液浸泡脱水处理百合胚性愈伤组 织40?60分钟； 4)液氮保存：保持百合胚性愈伤组织浸泡在玻璃化溶液中的状态，并将其置于液 氣中保存； 所述玻璃化溶液为含有0. 1?0. 5g/L石墨烯量子点的玻璃化冷冻。 优选地，所述 MS 培养液含有 1900mg/L KNO3,1650mg/L NH4NO3,170mg/L KH2PO4, 370mg/L MgSO4 ? 7H20,440mg/L CaCl2 ? 2H20, 37. 3mg/L Na2-EDTA, 27. 8mg/LFeS04 ? 7H20, lOOmg/L肌醇，0? 5mg/L烟酸，0? 5mg/L盐酸批咳醇，0? lmg/L盐酸硫胺素，2mg/L甘氨 酸，0.83mg/L KI，6. 2mg/L H3B03,22.3mg/L MnSO4.440,8.61^/1^1^04.71120,0.2511^/1 Na2MoO 4 ? 2H20,0? 025mg/L CuSO4 ? 5H20,0? 025mg/LCoCl2 ? 6H20,余量为水，所述 MS 培养液的 pH 为 5. 8。 优选地，上述步骤1)中所述预培养基为含有0. 4?0. 8mol/L蔗糖的MS固体培养 基。 优选地，上述步骤1)中所述预培养基为含有0. 7mol/L蔗糖的MS固体培养基。 优选地，所述 MS 固体培养基含有 1900mg/L KNO3,1650mg/L NH4NO3,170mg/LKH2P04， 370mg/L MgSO4 ? 7H20,440mg/L CaCl2 ? 2H20, 37. 3mg/L Na2-EDTA, 27. 8mg/LFeS04 ? 7H20, lOOmg/L肌醇，0? 5mg/L烟酸，0? 5mg/L盐酸批B多醇，0? lmg/L盐酸硫胺素，2mg/L甘氨酸， 0. 83mg/L KI,6. 2mg/L H3BO3, 22. 3mg/L MnSO4 ? 4H20, 8. 6mg/L ZnSO4 ? 7H20, 0. 25mg/L Na2MoO4 ? 2H20,0? 025mg/L CuSO4 ? 5H20,0? 025mg/L CoCl2 ? 6H20, 30g/L 蔗糖，lOg/L 琼脂粉， 余量为水，所述MS固体培养基的pH为5. 8。 更优选地，步骤1)中所述百合胚性愈伤组织在预培养基上培养的条件为：在4°C 下培养2天。 优选地，所述装载液为含有1?2mol/L丙三醇、0? 3?0? 5mol/L鹿糖和5? IOmmol/L KNO3 的 MS 培养液。 优选地，所述装载液为含有2mol/L丙三醇、0. 4mol/L蔗糖和lOmmol/L KNO3的MS 培养液。 优选地，上述步骤2)中，室温下，将百合胚性愈伤组织在装载液中浸泡处理60分 钟后移除装载液； 优选地，上述步骤3)中，在0°C下使用玻璃化溶液浸泡脱水处理百合胚性愈伤组 织60分钟。 优选地，所述玻璃化溶液为含有300g/L丙三醇，150g/L乙二醇，150g/L二甲基亚 砜、0. 4mol/L蔗糖和0. 1?0. 5g/L石墨烯量子点的MS培养液。 更优选地，所述玻璃化溶液为含有300g/L丙三醇，150g/L乙二醇，150g/L二甲基 亚砜、0. 4mol/L蔗糖和0. 1?0. 3g/L石墨烯量子点的MS培养液。 -种百合胚性愈伤组织的解冻及再培养方法，所述百合胚性愈伤组织为采用如上 述所述方法保存的百合胚性愈伤组织，所述百合胚性愈伤组织的解冻及再培养方法为将百 合胚性愈伤组织从液氮中取出，先水浴解冻，然后去除玻璃化溶液后用洗涤液洗涤，最后转 入恢复培养基中恢复培养。 优选地，水浴解冻的条件为在30?40°C的水浴中解冻60?120s。 更优选地，水浴解冻的条件为在40°C的水浴中解冻90s。 优选地，所述洗涤液为含有I. 0?I. 5mol/L蔗糖和5?lOmmol/L KNO3的MS培 养液。 优选地，所述洗涤液为含有I. 2mol/L蔗糖和lOmmol/L KNO3的MS培养液，洗涤工 艺为：用洗涤液在室温下将百合胚性愈伤组织浸泡10?30分钟。 更优选地，洗涤工艺为：用洗涤液在室温下将百合胚性愈伤组织浸泡30分钟，每 10分钟更换一次洗涤液。 优选地，所述恢复培养基为含有〇? 1?3. Omg/L毒莠定、0? 1?本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种优化百合胚性愈伤组织玻璃化超低温保存效果的方法，其特征在于，采用玻璃化法超低温保存的方法对百合胚性愈伤组织进行保存，具体步骤如下：1)预培养：将百合胚性愈伤组织置于预培养基上，在0～10℃下预培养1～4天；2)装载液处理：室温下，将百合胚性愈伤组织在装载液中浸泡处理40～60分钟后移除装载液；3)玻璃化溶液处理：在0～25℃下使用玻璃化溶液浸泡脱水处理百合胚性愈伤组织40～60分钟；4)液氮保存：保持百合胚性愈伤组织浸泡在玻璃化溶液中的状态，将其置于液氮中保存；所述玻璃化溶液为含有0.1～0.5g/L石墨烯量子点的玻璃化冷冻保护液。
【技术特征摘要】
1. 一种优化百合胚性愈伤组织玻璃化超低温保存效果的方法，其特征在于，采用玻璃 化法超低温保存的方法对百合胚性愈伤组织进行保存，具体步骤如下： 1) 预培养：将百合胚性愈伤组织置于预培养基上，在〇?10°C下预培养1?4天； 2) 装载液处理：室温下，将百合胚性愈伤组织在装载液中浸泡处理40?60分钟后移 除装载液； 3) 玻璃化溶液处理：在0?25°C下使用玻璃化溶液浸泡脱水处理百合胚性愈伤组织 40?60分钟； 4) 液氮保存：保持百合胚性愈伤组织浸泡在玻璃化溶液中的状态，将其置于液氮中保 存； 所述玻璃化溶液为含有〇. 1?〇. 5g/L石墨烯量子点的玻璃化冷冻保护液。2. 如权利要求1所述提高百合胚性愈伤组织保存效果的方法，其特征在于，所述百合 胚性愈伤组织预培养基为含有〇. 4?0. 8mol/L蔗糖的MS固体培养基。3. 如权利要求1所述优化百合胚性愈伤组织玻璃化法超低温保存效果的方法，其特征 在于，所述装载液为含有1?2mol/L丙三醇、0· 3?0· 5mol/L鹿糖和5?10mmol/L ΚΝ03 的MS培养液。4. 如权利要求1所述优化百合胚性愈伤组织...
【专利技术属性】
技术研发人员：张荻，任丽，陈冠群，申晓辉，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：上海;31
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。