重组植原体免疫主导膜蛋白的纯化方法及其应用技术

本发明专利技术提供了一种重组植原体免疫主导膜蛋白的纯化方法及其应用。上述重组植原体免疫主导膜蛋白的纯化方法，通过使用亲和层析法将重组菌表达的可溶性植原体免疫主导膜蛋白进行提纯，尤其是将包涵体裂解，结合利用透析法和亲和层析法对包涵体中的不溶性植原体免疫主导膜蛋白进行提纯，并通过对提纯的条件和工艺参数进行优化，从而大大提高重组植原体免疫主导膜蛋白的纯化效果，提纯度可达95%，而传统方法的提纯度为60%。该方法工艺简单、易于操作，并且产出量高、降低了生产成本。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术提供了一种重组植原体免疫主导膜蛋白的纯化方法及其应用。上述重组植原体免疫主导膜蛋白的纯化方法，通过使用亲和层析法将重组菌表达的可溶性植原体免疫主导膜蛋白进行提纯，尤其是将包涵体裂解，结合利用透析法和亲和层析法对包涵体中的不溶性植原体免疫主导膜蛋白进行提纯，并通过对提纯的条件和工艺参数进行优化，从而大大提高重组植原体免疫主导膜蛋白的纯化效果，提纯度可达95%，而传统方法的提纯度为60%。该方法工艺简单、易于操作，并且产出量高、降低了生产成本。【专利说明】重组植原体免疫主导膜蛋白的纯化方法及其应用
本专利技术属于生物
，具体涉及一种重组植原体免疫主导膜蛋白的纯化方法 及其应用。
技术介绍
植原体（phytoplasma)是一类GC含量比较低，无细胞壁，仅有3层单位膜包被的 原核微生物，专性寄生于植物和昆虫。植物染病主要症状包括丛枝、黄化、花变叶、花器退化 等，由于植原体侵染性强，危害寄主广泛，曾造成许多经济作物、林木的大量死亡，带来严重 的经济损失。由于植原体为无细胞壁原核微生物，尚不能在人工培养基上离体培养，给分 类鉴定、传播机制、致病机制的研究带来许多困难。因为蛋白质是最终遗传信息功能的实施 者，而且植原体缺乏细胞壁，其膜蛋白可以直接与植物的细胞质或介体昆虫的细胞接触，在 寄主和病原的相互作用中起着重要作用。因此研究植原体膜蛋白对于建立植原体血清学检 测方法，揭示植原体的进化、致病性及其与寄主的相互作用具有重要意义。 而免疫主导膜蛋白（immunodominant membrane proteins，IDPs)是大多数植原体 总细胞膜蛋白的主要部分。将各组植原体的免疫膜蛋白IDPs分成三种类型：（1)免疫主导 膜蛋白（immunodominant membrane protein，Imp)，代表性植原体有 SPWB、AP、ESFY、]3〕和 PYLR ; (2)免疫主导膜蛋白 A (immunodominant membrane protein A，IdpA)，代表性植原 体是WX ;(3)免疫抗原膜蛋白（antigenic membrane protein, Amp),代表性植原体是AY和 CP。1999年Michael Berg等从苹果丛枝植原体中分离出免疫主导膜蛋白（immunodominant membrane protein, Imp),并外源表达基因不同片段产物。研究中Berg等人分别在长春花 和烟草染病植株中检测到了分子量大约为19KDa大小相似的蛋白，序列分析表明该类蛋白 具有整合膜蛋白的特征，其N端暴露在细胞质一侧，一个疏水跨膜片段形成α螺旋锚定在 膜中，亲水的C端暴露在细胞外。2004年，Kakizawa等人克隆了植原体Sec (细胞分泌）系 统蛋白A、E、Y，且研究发现SecA有较强的免疫原性，其抗血清能检测多种植原体。但是由 于不同植原体膜蛋白特异性的差异，有些膜蛋白能够在大肠杆菌体系内完整表达，有些则 表达困难，且易形成包涵体，另一方面即使膜蛋白在大肠杆菌系统进行了表达，但由于膜蛋 白的疏水性、溶解度等性质为后续下游分离纯化膜蛋白造成了困难。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的上述不足，提供一种有效提高重组植原体免疫 主导膜蛋白纯化度的方法。 本专利技术的另一目的在于提供一种重组植原体免疫主导膜蛋白的应用。 为了实现上述专利技术目的，本专利技术实施例的技术方案如下： 获得表达植原体免疫主导膜蛋白的重组菌，诱导表达； 破碎经诱导表达后的重组菌，分离得到上清液一和沉淀物一； 将上述上清液一加入至树脂悬液与结合缓冲液混合液中，所述树脂悬液与所述结 合缓冲液的体积比为1?4 :1?5,在4?8°C的温度下振荡1?2小时后静置沉降，然后 依次经漂洗、洗脱处理，得到可溶性重组植原体免疫主导膜蛋白溶液； 将上述沉淀物一悬重洗涤后并经孵育处理，得到所述沉淀物一的溶解液；将所述 沉淀物一的溶解液加入至所述树脂悬液与所述结合缓冲液混合液中，该树脂悬液与结合缓 冲液的体积比为1?4 :1?5,在4?8°C的温度下振荡1?2小时后静置沉降，然后依次 经漂洗、洗脱处理，得到包涵体重组植原体免疫主导膜蛋白的溶液； 将所述可溶性重组植原体免疫主导膜蛋白溶液与所述包涵体中重组植原体免疫 主导膜蛋白的溶液进行透析浓缩，得到所述重组植原体免疫主导膜蛋白。 以及，一种上述重组植原体免疫主导膜蛋白的纯化方法所获得的重组植原体免疫 主导膜蛋白在医学免疫、克隆抗体、致病机理研究领域中的应用。 上述重组植原体免疫主导膜蛋白的纯化方法，通过使用亲和层析法将表达植原体 免疫主导膜蛋白的重组菌表达的可溶性蛋白进行提纯，尤其是将包涵体裂解，结合利用透 析法和亲和层析法对包涵体中的不溶性蛋白进行提纯，并通过对提纯的条件和工艺参数进 行优化，从而大大提高重组植原体免疫主导膜蛋白的纯化效果，提纯度可达95%，而传统方 法的提纯度为60%。该方法工艺简单、易于操作，并且产出量高、降低了生产成本。 正是由于上述重组植原体免疫主导膜蛋白的纯化方法所获得的重组植原体免疫 主导膜蛋白具有很高的纯度，可广泛应用于医学免疫、克隆抗体、分类鉴定、生理生化及其 致病机理的研究等领域。 【专利附图】【附图说明】 图1是本专利技术实施例重组植原体免疫主导膜蛋白纯化的方法工艺流程示意图； 图2是本专利技术实施例中构建重组质粒pET_28a ( + ) -Imp的示意图； 图3是本专利技术实施例分别将引物对一、引物对二、引物对三进行PCR扩增，将得到 的重组植原体免疫主导膜蛋白（Imp)基因后进行琼脂糖凝胶电泳检测，得到三种引物对扩 增的检测结果，其中Μ列为Marker，即分子量标准，1列为引物对一的检测结果，2列为引物 对二的检测结果，3列为引物对三的检测结果； 图4是本专利技术实施例将诱导表达后的重组菌和含空质粒的大肠杆菌得到的可溶 性蛋白和包涵体进行SDS-PAGE凝胶电泳得到的检测结果，其中Μ列为标准蛋白（marker)的 分子量，1列为包涵体的检测结果，2列为可溶性蛋白的检测结果，BSA列为参照的蛋白分子 量； 图5是将本专利技术实施例1?9中不同咪唑浓度条件下纯化得到的可溶性重组植 原体免疫主导膜蛋白溶液进行SDS-PAGE凝胶电泳得到的检测结果，其中Μ列为标准蛋白 (marker)的分子量，1?9列分别对应实施例1?9的检测结果； 图6为本专利技术实施例获得的不同量的可溶性重组植原体免疫主导膜蛋白与 lml50%Ni-NTA-His ·Β?ικ!树脂结合后再进行SDS-PAGE凝胶电泳得到的检测结果，其中Μ列 为标准蛋白（marker)的分子量，1列为10mg的可溶性重组植原体免疫主导膜蛋白的结合检 测结果，2列为8mg的可溶性重组植原体免疫主导膜蛋白的结合检测结果，3列为5mg的可 溶性重组植原体免疫主导膜蛋白的结合检测结果； 图7为本专利技术实施例纯化得到的包涵体重组植原体免疫主导膜蛋白溶液进行 SDS-PAGE凝胶电泳得到的检测结果，其中Μ列为标准蛋白（marker)的分子量，1列为第一 次洗脱的检测结果、2列为第二次洗脱本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种重组植原体免疫主导膜蛋白的纯化方法，包括如下步骤：获得表达植原体免疫主导膜蛋白的重组菌，诱导表达；破碎经诱导表达后的重组菌，分离得到上清液一和沉淀物一；将所述上清液一加入至树脂悬液与结合缓冲液混合液中，所述树脂悬液与所述结合缓冲液的体积比为1～4：1～5，在4～8℃的温度下振荡1～2小时后静置沉降，然后依次经漂洗、洗脱处理，得到可溶性重组植原体免疫主导膜蛋白溶液；将所述沉淀物一悬重洗涤后并经孵育处理，得到所述沉淀物一的溶解液；将所述沉淀物一的溶解液加入至所述树脂悬液与所述结合缓冲液混合液中，所述树脂悬液与所述结合缓冲液的体积比为1～4：1～5，在4～8℃的温度下振荡1～2小时后静置沉降，然后依次经漂洗、洗脱处理，得到包涵体重组植原体免疫主导膜蛋白的溶液；将所述可溶性重组植原体免疫主导膜蛋白溶液与所述包涵体中重组植原体免疫主导膜蛋白的溶液进行透析浓缩，得到所述重组植原体免疫主导膜蛋白。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：刘仲健，李利强，肖新菊，张丽君，罗焕亮，梁楠楠，
申请(专利权)人：深圳市兰科植物保护研究中心，
类型：发明
国别省市：广东;44