将靶向肽偶联于重组溶酶体酶上的方法技术

本申请描述了制备与重组溶酶体酶偶联的靶向肽的方法，其通过使用第一交联剂修饰重组人溶酶体酶的氨基(N)-末端和一个或多个赖氨酸残基以产生第一交联剂修饰的重组人溶酶体酶，使用第二交联剂修饰变体IGF-2肽的氨基(N)-末端的短延长接头的第一个氨基酸以产生第二交联剂修饰的变体IGF-2肽，然后将所述第一交联剂修饰的重组人溶酶体酶与所述含有短延长接头的第二交联剂修饰的变体IGF-2肽偶联。本申请还描述了使用本申请所公开的方法合成的偶联物，所述偶联物的特征为与IGF2/CI-MPR受体具有更高的亲和性和能够被细胞摄取。本申请还描述了使用所公开的偶联物的治疗方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】将靶向肽偶联于重组溶酶体酶上的方法相关申请的交叉引用本申请要求2011年5月27日提交的美国临时专利申请号61/490,957的优先权，其全部内容通过引用并入本申请。
本申请的
涉及肽化学。本申请的
还涉及在溶酶体贮积症的治疗中将重组溶酶体酶靶向至溶酶体。
技术介绍
溶酶体是一种专门的细胞内细胞器，蛋白质、多种脂质(包括糖脂和胆固醇)和碳水化合物在其中降解并重循环成最基本组分，这些最基本的组分能够合成新的蛋白、膜组分和其他分子。通过被称为自噬的适应性细胞过程，细胞还利用溶酶体帮助维持内环境稳态和细胞的健康，该过程增加溶酶体的活性以便为增加的多种蛋白质(例如，抗体和干扰素)的生物合成提供额外的氨基酸，并且为能量产生过程提供营养物以应对营养剥夺或病毒感染的应激期。各个代谢过程由特定的固有溶酶体酶催化。基因突变能够引起溶酶体生物活性的缺乏，其使得代谢过程改变并导致临床疾病。溶酶体贮积症(LSD)是由约50种不同的人类代谢疾病组成的一类疾病，其由缺乏特定的溶酶体蛋白引起，结果使得多种物质在内涵体/溶酶体区域蓄积。已对多种这些疾病进行了很好的鉴定以了解缺乏的溶酶体蛋白和其所导致的代谢缺陷。例如，存在糖脂分解代谢改变的若干LSD如戈谢氏症、法布瑞氏症和台萨氏/桑德霍夫病。鉴定Neimann-PickC为脂质和胆固醇代谢受损，还鉴定了碳水化合物代谢改变的疾病如II型(庞贝氏症)和III型(科里-法布瑞氏症)糖原贮存疾病。其他LSD改变骨或细胞外基质[例如，粘多糖贮积症(MPSI-VII)，戈谢氏症]的代谢和蛋白的更新(神经元蜡样脂褐质沉积症；Batten等)。尽管LSD相对罕见，但是如果未进行有效治疗，则其能够导致严重的慢性疾病并且往往会导致死亡。尚无能够治愈溶酶体贮积症的方法，但是已经研究了用于治疗多种LSD的多种不同的治疗方法，包括骨髓和脐带血移植、酶替代疗法(ERT)、底物减少疗法(SRT)和药物伴侣疗法。还开发了基因疗法但是尚未经临床检验。在这些治疗方法中，ERT是最成熟的，已有多种ERT被批准用于治疗多种LSD，包括戈谢氏症、法布瑞氏症、庞贝氏症、MPSI、MPSII和MPSVI，而仅有一种SRT药物被批准用于治疗戈谢氏症。ERT用于治疗溶酶体贮积症的原理相当明确，即将重组人溶酶体酶给予患者以补充其缺乏的生物活性并改善临床症状。然而，与主要在细胞表面或细胞外发挥功能的其他蛋白治疗疗法(例如，抗-VEGF和其他抗体、促红细胞生成素、凝血因子等)不同，溶酶体酶必须在细胞内的溶酶体内发挥功能，因而需要一种由细胞外进入细胞随后递送至这些内部区室的机制。在哺乳动物中，对大多数可溶性溶酶体酶而言，蛋白骨架上的分支碳水化合物结构在某些天冬酰胺残基(N-连接的寡糖；N-聚糖)上被翻译后修饰以形成称为甘露糖6-磷酸(M6P)的特殊碳水化合物结构。M6P是天然生物信号，其由膜结合M6P受体识别并将新合成的溶酶体蛋白从高尔基体向溶酶体转运。一类M6P受体(不依赖于阳离子的M6P受体；CI-MPR)还能够循环至质膜，并被功能性活化以结合和内化外源性的溶酶体蛋白。据信CI-MPR已发展成能够重新捕获从细胞中逃逸(分泌出细胞)的溶酶体蛋白，因此其提供了一种内化外源性溶酶体蛋白的靶机制，并且是治疗多种LSD的酶替代疗法的基础。重组溶酶体酶替代疗法已显示出广泛的安全性，但是其减轻临床症状的效果存在较大差异。例如：剂量为1mg/kg体重隔周给药一次的FabrazymeTM(重组酸性α-半乳糖苷酶A；GenzymeCorp.)足以从法布瑞氏症的内皮细胞中清除蓄积的底物，而剂量为40mg/kg隔周给药一次的MyozymeTM(重组人酸性α-葡糖苷酶，rhGAA；GenzymeCorp.)对庞贝氏症仅具有有限的疗效。疗效不同主要由M6P含量的不同所致，因而M6P水平较低与药物的靶向性不佳和较低的疗效相关。重组溶酶体酶的生产非常有挑战性，因为在哺乳动物表达系统内控制碳水化合物的加工特别是控制M6P的水平非常困难。两种特定的高尔基酶催化M6P的修饰；N-乙酰葡糖胺磷酸转移酶将连接了磷酸的N-乙酰葡糖胺添加在特定末端甘露糖残基上，而N-乙酰葡糖胺-1-磷酸二酯α-N-乙酰葡糖苷酶(也称为去覆盖酶)除去覆盖的N-乙酰葡糖胺以暴露出M6P信号。然而，N-乙酰葡糖胺磷酸转移酶仅限于在细胞内，并且该生化反应对多种溶酶体蛋白天生效率不高。在生产过程中过表达溶酶体蛋白大大加剧了这一问题，并且导致M6P的量存在较大差异。因而，碳水化合物的加工一般是不完全的，并且导致产生了具有N-聚糖混合物的重组溶酶体酶，N-聚糖混合物具有M6P、非M6P结构的高甘露糖型N-聚糖和复合型N-聚糖(一般为分泌性蛋白)。死亡或受损细胞释放除去M6P的酶(如磷酸酶)进入细胞培养基，这使问题更为复杂。因此，M6P的含量减少降低重组溶酶体酶与M6P受体的结合亲和性，并且减少了细胞摄取，进而降低了药物的疗效。死亡或受损细胞释放的其他糖苷酶，这些糖苷酶除去其他碳水化合物(例如，唾液酸、半乳糖等)从而暴露出通常不会暴露的内部的碳水化合物，而这些N-聚糖会被识别为异物。这些不完全的N-聚糖结构加快了重组溶酶体蛋白在循环中的清除率，这也会降低药物的疗效。因此，需要使用更高的药物剂量以抵偿降低的疗效。然而，更高药物剂量的需求具有多重负面影响：(1)更高的药物剂量可能会因增加本已昂贵的治疗成本而使人望而却步；(2)较高的药物剂量需要较长的输注时间；(3)较大量的循环药物会导致显著的抗体应答(见于大多数的庞贝氏症患者)，且在输注期间无数患者也经历了过敏反应。FDA已经对Myozyme下发了“黑色标签警告”，通常在开始时应非常缓慢的给予该药物而在输注过程中逐渐增加。这种策略有助于缓解过敏应答，但是显著延长输注时间，其中12小时输注的情况也并不少见。用于改善药物对多种溶酶体ERT靶向性的一种潜在策略为引入靶向肽以有效地将ERT靶向至溶酶体而不需要传统M6P碳水化合物结构。这在概念上是可行的，因为不依赖于阳离子的M6P受体含有针对称为胰岛素样生长因子2(IGF-2)的小肽的独特的结合结构域，因此将该受体称为IGF-2/(IGF-2/CI-MPR)。因为IGF-2/CI-MPR存在于细胞表面并在细胞表面发挥生物活性，所以该受体实际上仅负责内化外源性的负载M6P的溶酶体蛋白。因为在细胞表面不具有生物活性并且缺乏IGF-2肽结合结构域，所以其他类型的M6P受体，即阳离子依赖性M6P受体(CD-MPR)，仅与细胞内的溶酶体蛋白转运有关。IGF-2/CI-MPR具有两个独立的针对M6P的结合位点(分别为结构域1-3和7-9)，以使其以中度亲和性与单-M6PN-聚糖(在N-聚糖上有1个M6P残基)结合或者以约高3000倍的亲和性与双-M6PN-聚糖(在同一N-聚糖上有两个M6P残基)结合。由于溶酶体蛋白含有复杂(无M6P)、单-和双-M6PN-聚糖的混合物，因而其对IGF-2/CI-MPR的亲和性随着负载M6P的N-聚糖的类型和量的变化而大幅改变。IGF-2肽对IGF-2/CI-MPR具有最高的亲和性，其比单-M6PN-聚糖高约230,000倍。多种配体对IGF-2/CI-MPR的结合亲和性总结本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种与重组溶酶体酶偶联的靶向肽的制备方法，所述方法包括：使用第一交联剂修饰重组人溶酶体酶的氨基(N)‑末端和一个或多个赖氨酸残基以产生第一交联剂修饰的重组人溶酶体酶；使用第二交联剂修饰在变体IGF‑2肽的短延长接头的氨基(N)‑末端的第一个氨基酸以产生第二交联剂修饰的变体IGF‑2肽；和将所述第一交联剂修饰的重组人溶酶体酶与所述包含短延长接头的第二交联剂修饰的变体IGF‑2肽偶联。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2011.05.27 US 61/490,9571.一种与重组人溶酶体酶偶联的靶向肽的制备方法，所述方法包括：使用第一交联剂修饰重组人溶酶体酶的氨基(N)-末端和一个或多个赖氨酸残基以产生第一交联剂修饰的重组人溶酶体酶，其中：所述重组人溶酶体酶选自由以下组成的组：人酸性α-葡糖苷酶(rhGAA)、人酸性α-半乳糖苷酶A(GLA)、人酸性β-葡糖醛酸酶(GUS)、人酸性α-透明质酸酶A(IduA)、人酸性艾杜糖酸2-硫酸酯酶(I2S)、人β-氨基己糖苷酶A(HexA)、人β-氨基己糖苷酶B(HexB)、人酸性α-甘露糖苷酶A、人β-葡糖脑苷酶(GlcCerase)、人酸性脂肪酶(LPA)、及其任意组合；和所述第一交联剂选自琥珀酰亚胺6-肼基烟酸酯丙酮(S-Hynic)、琥珀酰亚胺4-盐酸酰肼基对苯二酸(SHTH)、琥珀酰亚胺4-盐酸酰肼烟酸(SHNH)、N-羟基琥珀酰亚胺酯-(PEG)n-酰肼、N-羟基琥珀酰亚胺酯-膦(NHS-膦)、硫代-N-羟基琥珀酰亚胺酯-膦(硫代-NHS-膦)、N-羟基琥珀酰亚胺酯-四氧杂十五烷乙炔(NHS-PEG4-乙炔)、N-羟基琥珀酰亚胺酯-(PEG)n-乙炔、或者NHS-PEG3-S-S-乙炔，其中n＝3-24；使用第二交联剂修饰在变体IGF-2肽的短延长接头的氨基(N)-末端的第一个氨基酸以产生第二交联剂修饰的变体IGF-2肽，其中：所述变体IGF-2肽由SEQIDNO:2所示的氨基酸序列表示；所述短延长接头由SEQIDNO:3所示的氨基酸序列表示；和所述第二交联剂选自PEG4-戊氟苯基苯甲酸酯(PEG4-PFB)、琥珀酰亚胺4-甲酰基苯甲酸酯(SFB)、C6-琥珀酰亚胺4-甲酰基苯甲酸酯(C6-SFB)、N-羟基琥珀酰亚胺酯-叠氮化物(NHS-叠氮化物)、N-羟基琥珀酰亚胺酯-(PEG)n-叠氮化物、或者NHS-PEG3-S-S-叠氮化物，其中n＝3-24；和将所述第一交联剂修饰的重组人溶酶体酶与所述包含短延长接头的第二交联剂修饰的变体IGF-2肽偶联。2.一种与重组人溶酶体酶偶联的靶向肽的制备方法，所述方法包括：将第一交联剂修饰的重组人溶酶体酶与一个或多个第二交联剂修饰的变体IGF-2肽偶联，其中：所述第一交联剂修饰的重组人溶酶体酶包括重组人溶酶体酶，其特征为具有第一交联剂修饰的N-末端和一个或多个经第一交联剂修饰的赖氨酸残基，其中所述第一交联剂选自琥珀酰亚胺6-肼基烟酸酯丙酮(S-Hynic)、琥珀酰亚胺4-盐酸酰肼基对苯二酸(SHTH)、琥珀酰亚胺4-盐酸酰肼烟酸(SHNH)、N-羟基琥珀酰亚胺酯-(PEG)n-酰肼、N-羟基琥珀酰亚胺酯-膦(NHS-膦)、硫代-N-羟基琥珀酰亚胺酯-膦(硫代-NHS-膦)、N-羟基琥珀酰亚胺酯-四氧杂十五烷乙炔(NHS-PEG4-乙炔)、N-羟基琥珀酰亚胺酯-(PEG)n-乙炔、或者NHS-PEG3-S-S-乙炔，其中n＝3-24；所述重组人溶酶体酶选自由以下组成的组：人酸性α-葡糖苷酶(rhGAA)、人酸性α-半乳糖苷酶A(GLA)、人酸性β-葡糖醛酸酶(GUS)、人酸性α-透明质酸酶A(IduA)、人酸性艾杜糖酸2-硫酸酯酶(I2S)、人β-氨基己糖苷酶A(HexA)、人β-氨基己糖苷酶B(HexB)、人酸性α-甘露糖苷酶A、人β-葡糖脑苷酶(GlcCerase)、人酸性脂肪酶(LPA)、及其任意组合；所述一个或多个第二交联剂修饰的变体IGF-2肽包括在变体IGF-2肽的短延长接头的氨基(N)-末端的经修饰的第一个氨基酸，其中所述变体IGF-2肽由SEQIDNO:2所示的氨基酸序列表示；所述短延长接头由SEQIDNO:3所示的氨基酸序列表示；和所述第二交联剂选自PEG4-戊氟苯基苯甲酸酯(PEG4-PFB)、琥珀酰亚胺4-甲酰基苯甲酸酯(SFB)、C6-琥珀酰亚胺4-甲酰基苯甲酸酯(C6-SFB)、N-羟基琥珀酰亚胺酯-叠氮化物(NHS-叠氮化物)、N-羟基琥珀酰亚胺酯-(PEG)n-叠氮化物、或者NHS-PEG3-S-S-叠氮化物，其中n＝3-24。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述重组人溶酶体酶包括人酸性α-葡糖苷酶(rhGAA)。4.根据权利要求1或2所述的方法，其中在重组人溶酶体酶上的两个赖氨酸残基被修饰。5.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述第一交联剂为N-琥珀酰亚胺6-肼基烟酸酯丙酮(S-Hynic)。6.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述第二交联剂为PEG4-戊氟苯基-4-甲酰基苯甲酸酯(PEG4-PFB)。7.根据权利要求1或2所述的方法，其中将所述重组人溶酶体酶上的N-末端和一个或多个赖氨酸残基在室温下在pH7.3的缺乏伯胺的缓冲液中修饰30分钟。8.根据权利要求7所述的方法，其中在所述重组人溶酶体酶上的N-末端和赖氨酸残基被修饰后，所述重组人溶酶体酶迅速交换进入酸性缓冲液。9.根据权利要求8所述的方法，其中所述酸性缓冲液pH5.0，包含50mM乙酸钠。10.根据权利要求8所述的方法，其中所述酸性缓冲液p...

【专利技术属性】
技术研发人员：H·杜，
申请(专利权)人：阿米库斯治疗学公司，
类型：发明
国别省市：美国;US