人肺炎支原体金标银染免疫层析检测试剂盒及其制备方法和应用技术

本发明专利技术提供了一种人肺炎支原体金标银染免疫层析检测试剂盒及其制备方法和应用，该检测试剂盒包括检测卡及银染增敏垫；检测卡由底板、样品垫、吸水垫、结合垫和检测层组成；结合垫包被有胶体金标记的兔抗人肺炎支原体P1蛋白及P30蛋白的多克隆抗体混合物；检测层是由带有一条检测线以及一条质控线的固相硝酸纤维素膜构成；检测层粘贴在底板上；结合垫和吸水垫分别与检测层部分重叠后分别与检测层和底板粘贴；样品垫与结合垫部分重合后分别与结合垫及底板粘贴；银染增敏垫则由AgNO3垫及还原垫组成。本发明专利技术能有效提高人肺炎支原体的检测灵敏度，特异性强，在人肺炎支原体的临床诊断、病原学鉴别、流行病学调查等方面具有很高的实用价值。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术提供了一种人肺炎支原体金标银染免疫层析检测试剂盒及其制备方法和应用，该检测试剂盒包括检测卡及银染增敏垫；检测卡由底板、样品垫、吸水垫、结合垫和检测层组成；结合垫包被有胶体金标记的兔抗人肺炎支原体P1蛋白及P30蛋白的多克隆抗体混合物；检测层是由带有一条检测线以及一条质控线的固相硝酸纤维素膜构成；检测层粘贴在底板上；结合垫和吸水垫分别与检测层部分重叠后分别与检测层和底板粘贴；样品垫与结合垫部分重合后分别与结合垫及底板粘贴；银染增敏垫则由AgNO3垫及还原垫组成。本专利技术能有效提高人肺炎支原体的检测灵敏度，特异性强，在人肺炎支原体的临床诊断、病原学鉴别、流行病学调查等方面具有很高的实用价值。【专利说明】人肺炎支原体金标银染免疫层析检测试剂盒及其制备方法和应用
本专利技术涉及医学检测
，具体为一种人肺炎支原体金标银染免疫层析检测试剂盒及其制备方法和应用。
技术介绍
肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae, Mp)是人类支原体肺炎的病原体,主要经飞沫传染，潜伏期2-3周，发病率以青少年最高。Mp感染在小儿肺炎病原的发生率高达10-30%，近年来逐渐成为小儿感染呼吸道疾病的主要病原体之一。该病极易引发咽炎、扁桃体炎等呼吸道感染，甚至可能同时继发脑膜炎、肝炎、心肌炎等多脏器损伤，严重时也可导致患儿死亡。 由于Mp感染与其它病原体引起的呼吸道感染症状类似，不做病原学检查,很难将Mp与其它病原体引起的呼吸道感染相区别。Mp无细胞壁，常用的β-内酰胺类药物对其无效，故其引起的感染的治疗与其它细菌和病毒感染的治疗方案完全不同，因此建立简便、快速、可行、能早期诊断肺炎支原体感染的方法非常必要。 目前Mp的检测方法主要有3类:一是分离培养法，其是证实感染的“金标准”，但由于Mp的生长周期极为缓慢，培养周期长，导致该法在临床上不能进行快速诊断；二是血清学方法，即采用酶联免疫法、胶体金免疫法、微量免疫荧光法和间接血凝试验等，检测被检者血清中Mp抗体水平，可间接提示Mp感染的存在。然而，血清学试验只能提供一种回顾性的诊断，而且有时需要双份血清。另外，抗体出现的时机不易掌握，儿童、青少年与成人之间又存在Mp特异性抗体的差异，并且，Mp细胞膜上的糖脂抗原与其他微生物及机体组织存在非特异性交叉反应，故现有血清学方法的检测质量受到一定限制；三是利用分子生物学技术检测Mp DNA的存在，其中最常用的是聚合酶链式反应(PCR)，该方法快速、灵敏、特异，是目前研究Mp感染的重要手段，但由于PCR对实验设备以及操作要求较高，且易出现假阳性，在我国还不能作为常用的临床诊断方法。因此，建立Mp特异性抗原诊断方法十分必要。目前，已公开报道的检测Mp抗原的方法主要为双抗夹心ELISA法，间接免疫荧光法，量子点标记免疫层析法等，但这些方法均不能实行床旁检测，需要到特定的场合利用特定的仪器(如酶标仪、荧光仪等)来检测，不仅不够方便快捷而且时间较长，临床应用较为不便。 免疫胶体金层析是近年来继放射免疫分析和酶联免疫分析之后发展起来的一种微量检测技术，其具有检测范围宽、操作简便快速(5-10分钟内)、可进行床旁检测等优点，是当前较为理想的免疫分析方法，但由于其灵敏度较低，限制了其临床应用。目前还没有见到基于免疫胶体金层析法检测肺炎支原体抗原的，灵敏度高、稳定性好的试剂盒。
技术实现思路
本专利技术针对
技术介绍
中现存的几种人肺炎支原体在检测方式中遇到的技术瓶颈，提出了一种具有操作简便、检测快速及高灵敏度等优点的人肺炎支原体金标银染免疫层析检测试剂盒及其制备方法和应用。 本专利技术的目的是通过以下技术手段来实现的: 一种人肺炎支原体金标银染免疫层析检测试剂盒，其特征在于:所述人肺炎支原体金标银染免疫层析检测试剂盒包括检测卡以及银染增敏垫；所述检测卡包括底板、样品垫、结合垫、检测层以及吸水垫；所述结合垫包被有胶体金标记的兔抗人肺炎支原体Pi蛋白及P30蛋白的多克隆抗体混合物；所述检测层是由带有一条检测线以及一条质控线的固相硝酸纤维素膜构成；所述检测线包被有鼠抗人肺炎支原体Pl蛋白及P30蛋白的多克隆抗体混合物；所述质控线包被有抗兔IgG ;所述检测层粘贴在底板上；所述结合垫以及吸水垫分别设置在检测层两端部的上方且与检测层部分重叠后分别与检测层以及底板粘贴在一起；所述样品垫设置在结合垫上方且与结合垫部分重合后分别与结合垫及底板粘贴在一起；所述银染增敏垫包括AgNO3垫以及还原垫；所述AgNO3垫由含有AgNO3的玻璃纤维膜构成；所述还原垫由含有苯二酚的玻璃纤维膜构成。 作为优选，本专利技术所采用的胶体金是直径范围是20-50nm的胶体金，优选40nm的胶体金。 作为优选，本专利技术所采用的抗兔IgG包括但不限于羊抗兔IgG。 作为优选，本专利技术所采用的检测层长2cm，所述检测层粘贴在长度是6.6-7.7cm的底板表面中间段；所述检测层与粘贴在检测层以及底板上的且长度是2.5-3cm的吸水垫重叠0.2-0.4cm ;所述检测层与粘贴在检测层以及底板上的且长度是0.5-0.8cm的结合垫重叠0.2-0.4cm ;所述结合垫与粘贴在结合垫以及底板上的长度是2.5cm的样品垫重叠0.2— 0.4cm ;所述检测线与质控线的间距是0.5-0.8cm ;所述底板的宽度是0.3-0.5cm。 作为优选，本专利技术所采用的吸水垫是吸水滤纸；所述底板是PVC板。 一种基于上述的人肺炎支原体金标银染免疫层析检测试剂盒的制备方法，其特征在于:所述制备方法包括以下步骤: I)结合垫的制备: 1.1)重组Pl-His、P30-His融合蛋白的制备、纯化: 1.1.1)对人肺炎支原体膜蛋白Pl及P30进行生物信息学分析，分别获取其胞外结构域中抗原表位最为丰富的肽段； 1.1.2)找到步骤1.1.1)中所得到肽段对应的基因编码序列，根据大肠杆菌中密码子的偏好性，对步骤1.1.1)中所得到基因编码序列进行密码子优化； 1.1.3)在步骤1.1.2)中所得到的基因序列的5’端及3’端分别引入酶切位点并分别化学合成全基因序列，同时标记记为pl、p30 ;其基因和蛋白序列参见序列表； 1.1.4)将步骤1.1.3)中所得到的Pl及p30按分子生物学方法分别克隆入表达载体pET-28a(+)后转入大肠杆菌中表达重组Pl-His、P30-His融合蛋白；所述重组Pl-His融合蛋白以可溶性方式存在于菌体中；所述重组P30-His融合蛋白则以包涵体形式存在于基因工程菌菌体内； 1.1.5)用镍柱分别纯化步骤1.1.4)所得到的重组Pl-His、P30_His融合蛋白，SDS-PAGE检测其纯度后，以Bradford法测定蛋白质浓度，将此二蛋白调整浓度均为0.2mg/mL后备用； 1.2)重组Pl-His、P30_His融合蛋白多克隆抗体IgG的制备: 1.2.1)以步骤1.1.5)中所得到的重组Pl-His、P30_His融合蛋白为完全抗原，分别免疫新西兰大白兔及豚鼠；分别制备兔抗重组Pl-His、P30-His融合蛋白抗血清及鼠抗重组Pl-His、P30-His融合蛋白抗血清；所述兔抗重组Pl-His、P3本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种人肺炎支原体金标银染免疫层析检测试剂盒，其特征在于：所述人肺炎支原体金标银染免疫层析检测试剂盒包括检测卡以及银染增敏垫；所述检测卡包括底板、样品垫、结合垫、检测层以及吸水垫；所述结合垫包被有胶体金标记的兔抗人肺炎支原体P1蛋白及P30蛋白的多克隆抗体混合物；所述检测层是由带有一条检测线以及一条质控线的固相硝酸纤维素膜构成；所述检测线包被有鼠抗人肺炎支原体P1蛋白及P30蛋白的多克隆抗体混合物；所述质控线包被有抗兔IgG；所述检测层粘贴在底板上；所述结合垫以及吸水垫分别设置在检测层两端部的上方且与检测层部分重叠后分别与检测层以及底板粘贴在一起；所述样品垫设置在结合垫上方且与结合垫部分重合后分别与结合垫及底板粘贴在一起；所述银染增敏垫包括AgNO3垫以及还原垫；所述AgNO3垫由含有AgNO3的玻璃纤维膜构成；所述还原垫由含有苯二酚的玻璃纤维膜构成。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：胡征，杨波，
申请(专利权)人：湖北工业大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42