分枝杆菌鉴定方法、试剂盒、通用引物对及rpsA基因的应用技术

本发明专利技术属于微生物的分子菌种鉴定领域，涉及一种分枝杆菌鉴定方法、试剂盒、通用引物对及rpsA基因的应用。其中，rpsA基因应用在分枝杆菌的菌种鉴定中，所述rpsA基因可通过包括正向引物和反向引物的通用引物对扩增获得。通用引物对包括正向引物和反向引物，其用于扩增分枝杆菌的rpsA基因。分枝杆菌的种属鉴定方法利用所述通用引物对进行PCR扩增，获得待测菌株的rpsA基因片段，测序后比对从而鉴定待测菌株的种属。分枝杆菌的分类鉴定试剂盒，应用rpsA基因进行分枝杆菌菌种鉴定，包括直接检测rpsA基因的PCR技术或以此基础为基础的其它检查技术。本发明专利技术对分枝杆菌的种属分类鉴定结果准确可靠、方法简单、鉴定速度快；通用引物对能鉴定绝大多数常见的非结核分枝杆菌临床分离株。

【技术实现步骤摘要】
分枝杆菌鉴定方法、试剂盒、通用引物对及rpsA基因的应用
本专利技术属于生物
，涉及微生物的分子鉴定领域；尤其涉及一种分枝杆菌鉴定方法、试剂盒、通用引物对及rpsA基因的应用。
技术介绍
结核病仍然是严重的公共卫生问题，尤其是在发展中国家。据WHO统计世界人口的1/3有结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)感染，是全世界感染性疾病中的第一大杀手。我国是全世界22个结核病高负担国家之一，活动性肺结核病人数居世界第二位。目前我国全年龄组结核菌感染率为44.5％，全国约5.5亿人受到结核菌感染。而非结核分枝杆菌（Non-tuberculousmycobacteria，NTM）感染在我国总体也呈上升趋势，1984/1985年第二次全国结核病流行病学调查(简称流调)NTM发病率为4.2%，1990年第三次流调为4.9%，2000年第四次流调则增至11.1%，而在2010年第五次流调中则上升为22.9%。然而这个比率远低于欧洲和美国的发病率（＞40%）。按照流行病学的理论，随着国家结核病防治规划效果的日益显现，NTM在结核病总体发病中所占的比率逐步提高。因此，预计我国未来NTM的发病率仍有上升空间，所以对NTM的研究也应该提高重视程度。NTM病临床表现与结核病相似，在无菌种鉴定结果的情况下，经常被误诊为结核病。而临床对于感染了结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌的患者治疗方案完全不同：非结核分枝杆菌多数对常用的抗结核药物天然耐药（NTM耐多药率高达83.7%），但一些广谱的抗生素对治疗NTM感染有效，而这些广谱抗生素对结核分枝杆菌感染的抗菌作用很弱，甚至没有作用；常见的能够致病的NTM有30余种，针对不同种NTM治疗的药物选择存在较大差异。因此在临床上，快速准确地判定患者是否存在NTM感染，是何种NTM感染，对临床治疗具有重要意义。目前临床上常用的鉴定NTM的方法分为两大类，一类是传统生化的方法，操作繁琐并且不够准确，所以已基本被弃用，仅有含对硝基苯甲酸（PNB）的选择性培养基法仍然广泛使用，用于初步区分结核分枝杆菌复合群（MTC）和NTM；另一类为分子生物学方法，以比较同源基因/序列的序列差异来鉴定NTM至种水平，该方法以操作简单、快速、能够鉴定分枝杆菌至种水平等优势成为目前最常用的方法，并且已经衍生出了各类商业试剂盒(如DNA芯片技术,线形探针杂交技术)应用于临床。目前最见的用于分枝杆菌菌种鉴定的同源基因/序列包括：16srRNA编码基因、16s-23srRNA间区（ITS）、hsp60和rpoB基因。采用单一的基因或现有基因组合对NTM的鉴别依然仅能鉴定常见致病NTM中的一部分，少量NTM由于种间序列的高度同源性，现有的鉴定技术不能够区分。如鸟分枝杆菌复合群、海分枝杆菌和溃疡分枝杆菌，即使联合使用16srRNA编码基因和ITS,也不能区分。现有的鉴别技术鉴定为同一种的分枝杆菌，有可能被新的标识鉴定为几种分枝杆菌或分为几个亚种，如经16srRNA基因和ITS鉴定为脓肿分枝杆菌的菌群，在结合使用hsp60和rpoB基因后，进一步分为了脓肿分枝杆菌、M.massiliense和M.bolletii。目前对分枝杆菌菌种鉴定技术主要关注的是其鉴定NTM至种的能力，实际上通过更多的分子标识的使用，有可能将同一种NTM分为更多的亚型，更细致的分型不仅有助于流行病学研究，而且当与患者的病史结合时，还有可能建立不同亚型与患者发病的联系，由此了解宿主的免疫机制与发病机制，类似的研究在国际上还未被关注过。因此，发现更多的分子标识，提高分枝杆菌菌种鉴定技术的鉴别能力，对临床诊断和治疗具有重要的参考价值。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种分枝杆菌鉴定方法、试剂盒、通用引物对及rpsA基因的应用。本专利技术第一方面提供了rpsA基因在分枝杆菌菌种鉴定中的应用。rpsA基因（作为一种新的分子标识）用于在分枝杆菌菌种鉴定中，通过一种通用引物对，包括正向引物和反向引物，扩增分枝杆菌（Mycobacterium）的rpsA基因，从而鉴定或区分不同的分枝杆菌。优选的，其中所述正向引物为5’-CCCTACATCGGCAAGGAG-3’(SEQIDNo：1)，所述反向引物为5’–TGTCGATGACCTTGACCATC-3’（SEQIDNo：2）。其中，正向引物，位于结核分枝杆菌的rpsA基因的487-504位置，genebank号为NC_000962.2；反向引物位于结核分枝杆菌的rpsA基因的1032-1051位置，genebank号为NC_000962.2。本专利技术第二方面提供了一种通用引物对，所述通用引物对包括正向引物和反向引物，其用于扩增分枝杆菌Mycobacterium的rpsA基因，其中所述正向引物如SEQIDNo：1所示，所述反向引物如SEQIDNo：2所示。该引物对扩增分枝杆菌（Mycobacterium）的rpsA基因，本专利技术还将引物对应用于检测分枝杆菌或鉴定分枝杆菌。本专利技术第三方面提供了一种分枝杆菌的种属鉴定方法，该方法利用上述通用引物对进行PCR扩增，获得待测菌株的rpsA基因片段，测序后比对从而鉴定待测菌株的种属。优选的，所述方法包括如下步骤：a)以待测菌株的基因组DNA为模板，以正向引物和反向引物进行PCR扩增，对扩增所得DNA片段进行回收、纯化、测序，得rpsA基因序列；b)根据序列测定结果构建系统发育树，获得鉴定结果。更优选的，上述方法的步骤b)为：将序列测定结果与GenBank数据库中所有的分枝杆菌的rpsA基因序列进行BLAST比对，构建系统发育树，获得鉴定结果。或者更优选的，步骤b)为：利用ClustalX软件对待测菌株的rpsA基因序列进行多序列重排；其间同时加入不同分枝杆菌菌种的标准菌株的rpsA基因序列，利用MEGA软件建立包含多种分枝杆菌标准株的系统发育树，在系统发育树中与待测菌株亲缘关系最近的标准菌株所对应的种，即为该菌株所属的种。更优选的，上述方法的步骤a)中PCR扩增的具体操作为：扩增反应体系25μl，正向引物浓度及反向引物浓度分别为20pmol，模板DNA50ng，Taq酶1U，脱氧核苷三磷酸终浓度250μM，MgCl2终浓度1.5mM；扩增反应条件为：95℃变性5分钟，之后循环30次（95℃30秒，56℃30秒，72℃30秒），72℃延伸5分钟。本专利技术第四方面还提供了一种分枝杆菌的分类鉴定试剂盒，应用rpsA基因进行分枝杆菌菌种鉴定，包括直接检测rpsA基因的PCR技术或以此基础为基础的其它检查技术。所述试剂盒包含SEQIDNo：1所示的正向引物和SEQIDNo：2所示的反向引物。所述试剂盒还包括dNTPs、10×Buffer、TaqDNA聚合酶和超纯水。本专利技术还提供了将上述通用引物对、扩增引物对、或试剂盒应用于制备鉴定分枝杆菌的产品中。举例来说，本专利技术的鉴定分枝杆菌种属的方法，包括如下步骤：S10、使用上述引物分别扩增多种分枝杆菌标准株的rpsA基因；S20、对扩增后的分枝杆菌标准株的rpsA基因进行测序；S30、对待鉴定的临床分离株的rpsA基因用步骤S10中的引物进行扩增并测序；S40、对扩增后的rpsA基因进行多序列重排，根据临床分离株与标准株的序本文档来自技高网...

【技术保护点】
rpsA基因在分枝杆菌菌种鉴定中的应用。

【技术特征摘要】
1.rpsA基因在制备分枝杆菌菌种的分类鉴定试剂盒中的应用，其中所述分枝杆菌菌种包括非结核分枝杆菌菌种，所述rpsA基因为所述分枝杆菌菌种的rpsA基因。2.权利要求1所述的应用，其中所述rpsA基因通过包括正向引物和反向引物的通用引物对扩增获得。3.权利要求2所述的应用，其中所述正向引物如SEQIDNo：1所示，所述反向引物如SEQIDNo：2所示。4.通用引物对，其特征在于所述通用引物对包括正向引物和反向引物，其用于扩增分枝杆菌Mycobacterium的rpsA基因，其中所述正向引物如SEQIDNo：1所示，所述反向引物如SEQIDNo：2所示。5.一种制备分枝杆菌的分类鉴定试剂盒的方法，该方法利用权利要求4所述通用引物对进行PCR扩增，获得待测菌株的rpsA基因片段，测序后比对从而鉴定待测菌株的种属。6.权利要求5所述方法，该方法包括如下步骤：a)以待测菌株的基因组DNA为模板，以正向引物和反向引物进行PCR扩增，对扩增所得DNA片段进行回收、纯化、测序，得rpsA基因序列；b)根据序列测定结果构建系统发育树，获得鉴定结果。7.根据权利要求6所述方法，其特征在于，所述步骤b)为：将序列测定结果与GenBank数据库中所有的分枝杆菌的rpsA基因序列进行BLAST比对，构建系统发育树...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄海荣，刘冠，段鸿飞，姜广路，戴广明，
申请(专利权)人：黄海荣，
类型：发明
国别省市：北京;11