一种基于微流控芯片的农药残留检测方法技术

本发明专利技术公开了一种基于微流控芯片的农药残留检测方法，属于农产品安全检测技术领域。本发明专利技术利用微电极具有体积小、传质速率快、扩散层薄等优点，将一定量蛋白A通入微流控芯片中，一方面与基底金原子紧密结合，另一方面与免疫球蛋白分子Fc片段高亲和力结合的位点，实现抗体在修饰界面的定向固定。整个试验过程中，对参数进行优化，获得最佳的测试条件：10µL/min作为流量、100mV作为外部施加电压、选取10min作为微流泵的通液时间。制备出的毒死蜱免疫传感器，通过计算接触样品前后免疫传感器的阻抗值的变化，获得样品中毒死蜱农药的浓度信息。该传感器其在1-1.0×104ng/mL浓度范围检测毒死蜱的线性关系良好，可用于实际样品中目标成分毒死蜱的检测。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了，属于农产品安全检测
。本专利技术利用微电极具有体积小、传质速率快、扩散层薄等优点，将一定量蛋白A通入微流控芯片中，一方面与基底金原子紧密结合，另一方面与免疫球蛋白分子Fc片段高亲和力结合的位点，实现抗体在修饰界面的定向固定。整个试验过程中，对参数进行优化，获得最佳的测试条件：10μL/min作为流量、100mV作为外部施加电压、选取10min作为微流泵的通液时间。制备出的毒死蜱免疫传感器，通过计算接触样品前后免疫传感器的阻抗值的变化，获得样品中毒死蜱农药的浓度信息。该传感器其在1-1.0×104ng/mL浓度范围检测毒死蜱的线性关系良好，可用于实际样品中目标成分毒死蜱的检测。【专利说明】
本专利技术涉及，属于农产品安全检测技术 领域。 技术背景 世界上化学农药年产量近200万吨，约有1000多种人工合成化合物被用作杀虫 齐U、杀菌剂、杀藻剂、除虫剂、落叶剂等类农药。农药尤其是有机农药大量施用，造成严重的 农药污染问题，成为对人体健康的严重威胁。农药进入粮食、蔬菜、水果、鱼、虾、肉、蛋、奶 中，造成食物污染，危害人的健康。一般有机磷农药在人体内代谢速度很慢，累积时间长。 残留在土壤中的农药通过植物的根系进入植物体内，农药进入河流、湖泊、海洋，造成农药 在水生生物体中积累。在自然界的鱼类机体中，含有机磷杀虫剂相当普遍，浓缩系数为5? 40000倍。虽然近年来国际上在蔬菜上已禁用该农药，但由于其对某些作物具有生长刺激作 用，所以仍有不少违章使用现象，因此实现对农药的检测是至关重要的。 微流控芯片是微流控技术实现的主要平台。其装置特征主要是其容纳流体的有效 结构(通道、反应室和其它某些功能部件）至少在一个纬度上为微米级尺度。该试验中应用 的微流控芯片中反应室中为微阵列电极，其拥有低电阻电压降、快速建立稳态系统、快速的 反应动力学和提高信噪比等优点，其反应时间短，分析效率高，许多分析过程可以在数分钟 内完成；样品和试剂消耗量少，能源消耗低；因而在病毒、细菌等医学领域的检测中有所应 用。而传统的农药残留检测，虽然这些方法的选择性好、灵敏度高和准确度高，同时检测多 种元素或化合物，但其需要昂贵的仪器设备，样品的前处理过程繁琐、费时，并且对分析人 员的技术水平要求很高，不适于现场快速检测。因此本文尝试制备一种毒死蜱残留的免疫 传感器。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种能克服上述方法的缺陷，且体积小、比表面积高、集成 化、便携化、选择性好的毒死蜱农药残留检测的免疫传感器检测方法。采用的技术方案为： 利用微流控芯片的集成化、便携化，将蛋白A通入微流控芯片中从而与基地金电极结合，蛋 白A和金原子的分子间作用力使两者紧密结合，另外，蛋白A分子中有四个与免疫球蛋白分 子Fc片段高亲和力结合的位点，使农药抗体定向固定在电极表面，从而使抗原抗体反应更 有效，检测电极表面的阻抗值，研究该传感器的电化学性能。 所述方法的步骤如下： 1) 首先对微流控芯片清洗，测试其阻抗值的变化； 2) 将步骤1)所得微流控芯片进行流量、外加电压、液体通入时间等参数，进行优化，筛 选出最佳的试验取值； 3) 将步骤2)所得的微流控芯片中，在最优条件下通入蛋白A，将其固定在芯片表面， 从而获得蛋白A修饰界面； 4) 在步骤3)所得蛋白A修饰芯片中通入抗体，使其与蛋白A结合后获得抗体修饰界 面； 5) 利用抗原抗体间的特异性反应，通入不同浓度的毒死蜱农药，用磷酸盐缓冲液 (PBS)冲洗后进行阻抗检测，建立不同毒死蜱农药浓度与微流控芯片阻抗变化之间的关系 曲线； 6 ))将果蔬样品液通入微流控芯片中，用PBS冲洗10 min后进行阻抗检测，获得果蔬样 品中是否含有毒死蜱农药及是否超标的信息。 所述方法的步骤1)所述清洗并测试微流控芯片，是分别通入一定量的氢氧化钠、 氯化氢等一段时间，再通入双蒸水，冲洗干净；最终，经超纯水冲洗后，进行阻抗谱扫描，与 上次裸电极的结果对比，两者基本重合，则说明清洗干净，否则需要重新清洗。 所述方法的步骤2)所述流量、外加电压和液体通入时间等参数进行了优化：流量 选取值在5-35 μ?7π?η;外加电压选取范围在10-100 mV;液体通入时间1-10 min，对不同 条件下的阻抗值进行分析测试，确定微流控芯片测试过程中的最佳参数。 所述方法的步骤3)所述通入不同浓度的蛋白A溶液，通入的流量为10 μ?νπ?η，固 定 90 min〇 所述方法的步骤4)所述通入不同浓度的毒死蜱抗体溶液，通入的流量为10 μ?ν min，固定2 h，孵育温度为4 ° C。 所述方法的步骤5)所述通入不同浓度的毒死蜱农药，通入的流量为10 μ?νπ?η，用 PBS冲洗后进行阻抗检测。 所述方法的步骤6)所述通入不同浓度的毒死蜱农药，通入的流量为10 μ?νπ?η，孵 育30 min后用PBS冲洗10 min后进行阻抗检测。 所述方法的具体步骤如下： 1) 微流控芯片的清洗：首先通入0.1 Μ氢氧化钠，静止1 h，通入双蒸水30 min，冲洗 干净；再通入0.1 Μ氯化氢，静止1 h，通入双蒸水30 min，冲洗干净；整个试验清洗中的通 速都采用10 μ?νπ?η;最终，经超纯水冲洗后，进行阻抗谱扫描，与上次裸电极的结果对比， 两者基本重合，则说明清洗干净，否则需要重新清洗。获得清洗干净的微流控芯片，便于在 其表面进行修饰，保证构建传感器的准确性； 2) 所述流量、外加电压等参数进行了优化：流量分别再当通速很小的时候，液体在微 流控芯片通道中的速度很缓慢，通速慢慢增大的同时，通道中的液体对整个微流控芯片装 置的压力等也会随之而改变，导致整个流体的阻抗值表征为相关性增加，在10-100 μιν min，通速与测试液的阻抗值成一定的线性关系。考虑对微流控芯片的使用寿命影响，本试 验中选取10 μ?7π?η作为流速。在改变电压的同时，阻抗值几乎没有变化，趋于稳定。而鉴 于100 mV可以再保持阻抗可线性测量的同时，且克服噪音，故而选用100 mV作为外部施加 电压。在1-10 min，随之时间的延长，通入微流控芯片的液体量也逐渐增加，阻抗值也随之 增加，而随着10 min之后，阻抗值增加很不明显，趋于稳定，故而选取10 min作为微流泵的 通液时间； 3) 取蛋白A原液（1 mg/mL)，用PBS稀释不同倍数，配置10、100、200 yg/mL等不同浓 度，在上述确定的最优参数下，对其阻抗值进行测定，筛选出试验中定向固定抗体所用最佳 的浓度值，通入蛋白A溶液的速度为10 μ?7π?η，固定90 min。从而获得蛋白A修饰的免疫 传感器界面； 4) 取毒死蜱抗体原液（1 mg/mL)，用PBS稀释不同倍数，配置10、100、200 yg/mL等不 同浓度，对其阻抗值进行测定，筛选出试验所用最佳的浓度值100 μ g/mL，通入毒死蜱抗体 的流量为10 KL/min，固定2 h，孵育温度为4 ° C。进而完成抗体在修饰界面的固定； 5) 通入不同浓度的毒死蜱农药，通入的流量为10 μ?7π?η，用PBS冲洗后进行阻抗检 测，分析该免疫传感器对毒死本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于微流控芯片的农药残留检测方法，其特征在于，该传感器的组装过程为：将蛋白A通入微流控芯片中，蛋白A和金原子紧密结合，且与农药抗体的Fc端结合而使其定向固定；再将毒死蜱抗体通入微流控芯片中；最后，利用抗原抗体间的特异性反应，通入不同浓度的农药，用磷酸盐缓冲溶液（PBS）冲洗后进行阻抗检测，进而制备出了一种新型的农药残留免疫传感器；根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述农药分子为毒死蜱农药。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：郭业民，曹瑶瑶，孙霞，王相友，刘君峰，
申请(专利权)人：山东理工大学，
类型：发明
国别省市：山东;37