一种羧基化的荧光微球、制备方法及其应用技术

本发明专利技术涉及一种羧基化的荧光微球、制备方法及其应用。采用水解反应方法制备得到侧链带有羧基的聚亚芳香基乙炔撑聚合物，经N-(3-二甲氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺将羧基活化后，以5μm单分散性氨基改性的多孔聚甲基丙烯酸缩水甘油酯APGMA微球为基质球，荧光聚合物将以共价键结合在APGMA微球上，从而制备得到基于共轭聚合物的羧基化的荧光微球，该荧光微球具有生物反应位点。本发明专利技术提供的荧光微球具有良好的生物偶联性能，可检测到生物分子BSA。若将所需的抗体通过聚合物侧链上的羧基偶联微球上，得到具有抗体标记的荧光微球，可用于相应抗原的检测。

【技术实现步骤摘要】
一种羧基化的荧光微球、制备方法及其应用
本专利技术涉及荧光共轭聚合物传感材料
，特别涉及一种基于共轭聚合物的具有用于生物偶联的反应位点的荧光微球、制备方法及其应用。
技术介绍
在提高整个人类社会公众健康的良好愿景下，高通量技术诊断检测在学术和临床领域已引起研究者极大的关注。与基于如平面阵列等常规方法的测定法相比，新出现的基于微球的悬浮阵列具有许多优点。通常，悬浮阵列技术由于球体的高流动性可以达到更快的检测速度；由于可以与分析物在三维空间中结合因而具有高灵敏性；检测结果是基于超过10,000个微球的统计信息的特点也使悬浮阵列技术的精度更高；此外由于便利的洗涤和分离步骤使得悬浮阵列技术也更易操作（TRENDSinBiotechnology2002,20,9;LabonaChip2003,3,60N;Journalofbiomolecularscreening2004,9,173;AngewandteChemieInternationalEdition2006,45,6104;Science2007,315,1393;Currentopinioninpharmacology2007,7,527）。荧光微球是悬浮阵列最常用也至关重要的载体。这些微球必须具备一些便于信号读取和分析的特性，如尺寸在微米级别上并且具有单分散性，均匀稳定的发光性，最好具有羧基或氨基的基团可以直接与生物分子结合以便检测的进行等。目前适合于这种技术的商业可用的荧光微球数量有限且非常昂贵。因此非常迫切需要发展新的方法以可接受的成本来制造足够的具有所需性能的荧光微球并使最普通的人受益。共轭聚合物（CPs）作为荧光团，拥有许多独特的优点：如耐光漂白性，结构易于调整，和高的热/机械稳定性（AngewandteChemieInternationalEdition2001,40,2591;Chemicalreviews2009,109,897）。然而，尽管有许多报道采用有机染料或量子点制备荧光微球，但由于共轭聚合物的制备过程比较复杂，有关共轭聚合物应用于荧光微球的技术方案较少见报道。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术存在的不足，提供一种制备工艺简单，基于共轭聚合物的，具有用于生物偶联的反应位点的，可用于生物检测的荧光微球、制备方法及其应用。实现本专利技术目的的技术方案是提供一种羧基化的荧光微球的制备方法，包括如下步骤：1、采用水解反应制备得到侧链带有羧基或羧酸盐的聚亚芳香基乙炔撑聚合物CP1和CP2；所述CP1的结构式为:，所述CP2的结构式为:；2、制备浓度为1～20μM的CP1或CP2溶液，加入羧基活化剂N-(3-二甲氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺，对步骤1得到的侧链带有羧基的聚亚芳香基乙炔撑聚合物CP1或CP2的侧链羧基进行活化处理，得到CP1或CP2的羧基活化溶液；3、以直径为5μm的单分散性氨基改性的多孔聚甲基丙烯酸缩水甘油酯APGMA微球为基质球，将APGMA微球置于步骤2得到的CP1或CP2的羧基活化溶液中，常温下避光振荡处理3～6小时，经洗涤、干燥，得到羧基化的荧光微球APGMA-CP1或APGMA-CP2。本专利技术制备方法的一个具体方案是：步骤2中制备CP1溶液的方法为：将CP1溶于pH5～6的混合溶剂中；所述的混合溶剂包括四氢呋喃和缓冲溶液，所述缓冲溶液为摩尔浓度0.01～1M的无机钾盐或无机钠盐的水溶液。步骤2中制备CP2溶液的方法为：将CP2溶于pH5～6的缓冲溶液中,所述缓冲溶液为摩尔浓度0.01～1M的无机钾盐或无机钠盐的水溶液。所述的无机钠盐为Na2HPO4、NaH2PO4、NaCl、Na2SO4、NaHSO4、NaHSO3、Na2SO3、Na2CO3、NaHCO3、Na2B4O7中的一种，或它们的任意组合。所述的无机钾盐为K2HPO4、KH2PO4、KCl、K2SO4、KHSO4、K2CO3、KHCO3、KHSO3、K2SO3中的一种，或它们的任意组合。本专利技术技术方案还包括按所述的制备方法得到的羧基化的荧光微球。本专利技术提供的羧基化的荧光微球的应用，将荧光微球与生物分子进行共价结合，用于生物分子的检测。本专利技术以APGMA微球为基质球，它是直径为5μm的单分散性氨基改性的多孔聚甲基丙烯酸缩水甘油酯（APGMA）微球，为市售商品，由苏州纳微科技有限公司提供。本专利技术提供的基于共轭聚合物的具有用于生物偶联的反应位点的荧光微球，它是基于侧链带有羧基的共轭聚合物固定到APGMA微球上而得到的表面带有羧基的荧光微球。由于表面带有羧基，荧光微球具有良好的生物偶联性能，若将某种抗体通过聚合物侧链上的羧基偶联到本专利技术提供的微球上，可得到具有抗体标记的荧光微球，可用于相应抗原的生物检测。与现有技术相比，本专利技术的有益效果在于：1、本专利技术以直径为5μmAPGMA微球作为基质，用于装载荧光团，采用本专利技术技术方案控制荧光物质加载过程，得到的荧光微球具有良好的单分散性和尺寸可控的特点，能够容易地满足应用的要求。2、本专利技术同时引入PPE类共轭聚合物的强荧光和羧基基团，从而避免了在非均相体系中的后官能团化反应。3、与小分子荧光团相比，本专利技术中的共轭聚合物有更高的反应基团密度（即，每个重复单元含一对羧基），能够实现更加有效的固定。4、本专利技术中的官能化的共轭聚合物是通过共价键与微球结合，与静电吸附、疏水作用或封装等其他方法相比，具有荧光性能更为稳定的特性。5、通过流式细胞仪对所得到的荧光微球生物偶联能力进行评价及BSA的检测，与应用环境完全一致，为实际应用提供更准确的信息。附图说明图1是本专利技术实施例制备侧链带有羧基或羧酸盐的共轭聚合物的原料聚合物Pre-CP1和Pre-CP2的结构式；图2是本专利技术实施例制备的侧链带有羧基的共轭聚合物CP1和CP2的吸收和发射光谱图；图3是本专利技术实施例1制备共轭聚合物CP1及活化反应的路线示意图；图4是本专利技术实施例2制备共轭聚合物CP2及活化反应的路线示意图；图5是本专利技术实施例提供的具有用于生物偶联的反应位点的荧光微球的固体吸收和发射光谱图；图6是本专利技术实施例提供的具有用于生物偶联的反应位点的荧光微球的扫描隧道显微镜（SEM）照片；图7是采用流式细胞仪对本专利技术实施例提供的具有用于生物偶联的反应位点的荧光微球的检测结果图。具体实施方式下面结合附图和实施例对本专利技术技术方案作进一步的阐述。实施例11、CP1的制备参照文献JournaloftheAmericanChemicalSociety2004,126,14964;ACSAppliedMaterials&Interfaces2014,6,5041提供的原料，通过Sonogashira偶联反应制备侧链带有羧基的聚亚芳香基乙炔撑聚合物CP1，具体方法如下：参见附图1，其中的（a）图为本实施例的原料聚合物Pre-CP1的结构式(在文献ACSAppliedMaterials&Interfaces2014,6,5041中Pre-CP1对应记作P3)，将pre-CP1(1.03g)溶于1,4-二氧六环(160mL)，加入1Mn-Bu4NOH甲醇溶液(10mL)，常温下搅拌24小时。在聚合物水解的过程中，滴入几滴去离子水使聚合物处于溶液状态。待反应本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种羧基化的荧光微球的制备方法，其特征在于包括如下步骤：（1）采用水解反应制备得到侧链带有羧基的聚亚芳香基乙炔撑聚合物CP1或CP2；所述CP1的结构式为:，所述CP2的结构式为:  ；（2）制备浓度为1～20 μM的CP1或CP2溶液，加入羧基活化剂N‑(3‑二甲氨基丙基)‑N'‑乙基碳二亚胺盐酸盐和N‑羟基琥珀酰亚胺，对侧链带有羧基的聚亚芳香基乙炔撑聚合物CP1或CP2的侧链羧基进行活化处理，得到CP1或CP2的羧基活化溶液；（3）以直径为5 μm的单分散性氨基改性的多孔聚甲基丙烯酸缩水甘油酯APGMA微球为基质球，将APGMA微球置于步骤（2）得到的CP1或CP2的羧基活化溶液中，常温下避光振荡处理3～6 小时，经洗涤、干燥，得到羧基化的荧光微球APGMA‑CP1或APGMA‑CP2。

【技术特征摘要】
1.一种羧基化的荧光微球的制备方法，其特征在于包括如下步骤：（1）采用水解反应制备得到侧链带有羧基的聚亚芳香基乙炔撑聚合物CP1或CP2；所述CP1的结构式为:，所述CP2的结构式为:；（2）制备浓度为1～20μM的CP1或CP2溶液，加入羧基活化剂N-(3-二甲氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺，对侧链带有羧基的聚亚芳香基乙炔撑聚合物CP1或CP2的侧链羧基进行活化处理，得到CP1或CP2的羧基活化溶液；（3）以直径为5μm的单分散性氨基改性的多孔聚甲基丙烯酸缩水甘油酯APGMA微球为基质球，将APGMA微球置于步骤（2）得到的CP1或CP2的羧基活化溶液中，常温下避光振荡处理3～6小时，经洗涤、干燥，得到羧基化的荧光微球APGMA-CP1或APGMA-CP2。2.根据权利要求1所述的一种羧基化的荧光微球的制备方法，其特征在于：步骤（2）中制备CP1溶液的方法为：将CP1溶于pH5～6的混合溶剂中；所述的混合溶剂包括四氢呋喃和缓冲溶液，所述缓冲溶液为摩尔浓度0...

【专利技术属性】
技术研发人员：范丽娟，许海波，
申请(专利权)人：苏州大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32