一种抗菌肽及其在制备抗感染药物、抗肿瘤药物、免疫促进剂和饲料添加剂中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种小菜蛾抗菌肽及其在制备抗感染药物、抗肿瘤药物、免疫促进剂和饲料添加剂中的应用。所述小菜蛾抗菌肽的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。本发明专利技术的小菜蛾抗菌肽，对多种细菌均具有抑杀作用，能用于制备抗感染药物；对乳腺癌细胞、肝癌细胞、结肠癌细胞、肺癌细胞具有极显著的生长抑制作用，具有明显的体外抗肿瘤活性，能用于制备抗肿瘤药物；能促使CD4T细胞的增殖、促进其分泌IFNγ，同时能抑制IL4合成，调整Th1/Th2平衡，具备免疫促进活性，能用于制备免疫促进剂；用作饲料添加剂可显著提高仔猪的存活率，降低仔猪和育肥猪的腹泻率，提高仔猪和育肥猪的日增重，降低仔猪和育肥猪的料肉比。

【技术实现步骤摘要】
一种抗菌肽及其在制备抗感染药物、抗肿瘤药物、免疫促进剂和饲料添加剂中的应用
本专利技术属于生物
，具体涉及一种抗菌肽及其在制备抗感染药物、抗肿瘤药物、免疫促进剂和饲料添加剂中的应用。
技术介绍
抗菌肽(antibacterialpeptide)是一类在一定诱导条件下，由宿主细胞特定编码基因产生的、对抗外源性病原体致病作用的防御性多肽类的总称，具有广谱的抗菌、抗病毒作用，是天然免疫系统的组成部分。抗菌肽具有分子量小、稳定性高、无免疫原性等特点。部分抗菌肽具在l00℃下加热10～15min仍能保持其活性；同时，抗菌肽对较大的离子强度和较高或较低的pH值均具有较强的抗性，部分抗菌肽尚具备抵抗胰蛋白酶或胃蛋白酶水解的能力。1975年瑞典科学家G.Boman等人(Steinerhdetal.Nature,1981,292:246-248.)从惜古比天蚕(Hyatophoracecropia)的蛹中诱导分离得到一种杀菌肽，并将其命名为cecropin。此后许多抗菌肽相继被分离、纯化。一些抗菌肽的氨基酸一级结构和基因序列得到确定。其后的抗菌肽研究，早期主要集中在大型的经济昆虫来源的抗菌肽、其后又扩展到来源于一些小型昆虫、无脊椎动物及脊椎动物(特别是两栖动物)乃至哺乳动物的抗菌肽；另外，细菌和植物来源的抗菌肽也一直是研究的热点。已报道的抗菌肽除了具有广谱的抗菌、抗病毒作用外，还对部分原虫具备杀灭作用；更为令人感兴趣的是，一些抗菌肽对癌细胞具有强有力的杀伤作用，有些抗菌肽还具有免疫刺激功能。广袤自然界中还有更多具备强大功能的抗菌肽有待挖掘。抗菌肽中最大的一类阳离子抗菌肽，其作用机理是破坏细胞膜，破坏其完整性并产生穿孔现象，造成细胞内容物溢出胞外而死亡，而不是作用于某个靶点酶或者受体。所以在应用上，抗菌肽还具有传统抗生素无法比拟的优越性，即不会诱导抗药菌株的产生。鉴于抗菌肽的这些特点和功能，长期以来，许多科学家和技术人员致力于抗菌肽应用于抗菌药物、抗肿瘤药物、动物保健品和饲料添加剂等方面的研究和开发。但是，抗菌肽的天然产量低，天然提取步骤复杂、产率低；而化学合成则价格相当昂贵；所以利用基因工程技术生产抗菌肽，是抗菌肽开发利用产业化的必由之路，具有重要意义。而抗菌肽分子量小，重组表达时mRNA稳定性差，而且抗菌肽本身对某些工程菌就具有抑杀作用，所以，如何构建高表达工程菌也是个关键问题。
技术实现思路
本专利技术提供了一种抗菌肽基因，该基因表达的抗菌肽抗菌谱广，具有多种生物活性。一种抗菌肽基因，碱基序列如SEQID.No.1所示。该抗菌肽基因pxCA1是通过以下方法分离获得的：(1)将小菜蛾(Plutellaxylostella)幼虫饲养至4～7日龄，以针蘸取培养至对数期的大肠杆菌对小菜蛾腹部进行穿刺接种，继续饲养24h后提取幼虫总RNA；(2)对总RNA进行逆转录，获得cDNA；(3)以所述cDNA为模板，设计引物进行PCR，即获得所述小菜蛾抗菌肽基因；所述引物的碱基序列为：上游引物：5’-ATGAAACTGTCAAATATTTTCTTTTTC-3’；下游引物：5’-CTATTTCCCGGCAGGTCTAGCG-3’。所述抗菌肽基因经转录、翻译后得到的全长肽段的氨基酸序列如SEQIDNo.2所示。该全长肽段中，第1～22位氨基酸为信号肽，第23～24位氨基酸在翻译后被切除，第25～65位氨基酸为成熟肽，即为本专利技术所述抗菌肽，其氨基酸序列如SEQIDNo.3所示。为实现所述抗菌肽的大量表达，本专利技术对所述抗菌肽基因编码序列进行了密码子优化，人工合成获得了编码所述抗菌肽的基因，以适应具有不同密码子偏好的工程菌。本专利技术提供了两种编码抗菌肽的基因，其碱基序列分别如SEQIDNo.4和SEQIDNo.5所示；SEQIDNo.4所示的基因适合在大肠杆菌中表达，SEQIDNo.5所示的基因适合在酵母中表达。本专利技术还提供了含有所述基因的重组表达载体，以及含有所述重组表达载体的重组工程菌。本专利技术提供了两种重组工程菌，其中，重组工程菌A的出发菌株为大肠杆菌，所述基因的碱基序列如SEQIDNo.4所示；重组工程菌B的出发菌株为酵母菌，所述基因的碱基序列如SEQIDNo.5所示。由于所述抗菌肽对大肠杆菌具有较强的抑杀作用，以大肠杆菌作出发菌株时，要选择适当的表达载体。试验发现，采用pET32a质粒构建重组表达载体时，抗菌肽能实现融合蛋白形式的可溶性表达；而采用pET22b质粒构建重组表达载体时，抗菌肽在大肠杆菌中单独表达，不仅会抑制大肠杆菌的生长甚至引发菌体自溶，导致实际表达量极低，实际应用价值不大。当以酵母菌作出发菌株时，优选采用pGAPZαA质粒构建重组表达载体。pGAPZαA质粒含丙酮酸激酶强启动子，能够启动插入基因的组成型表达，不需要甲醇诱导，表达产物随菌体增殖而自然累积并分泌至胞外，发酵上清不含有毒物质甲醇，可直接作为饲料添加剂加以利用。本专利技术所述抗菌肽可采用以下方法制备：(i)将重组工程菌A活化后接种至大肠杆菌发酵培养液中，发酵至OD600为0.5以上后加入IPTG诱导表达；所述大肠杆菌发酵培养液可选用M9补料培养基，IPTG的终浓度为0.2～1mM，于37℃下诱导表达3～4h(OD600达1.5以上)；(ii)收集菌体并对其进行超声破碎，离心收集上清液，过镍柱亲和层析获得融合蛋白，融合蛋白经肠激酶剪切后再过镍柱，获得初步纯化的抗菌肽原液；进一步过阳离子交换柱，即可获得纯化的抗菌肽原液；或者，采用以下方法制备：将重组工程菌B活化后接种至酵母发酵培养液中，发酵后收集发酵上清液；所述酵母菌优选为毕赤酵母，所述酵母发酵培养液可选用YPD培养基或无机盐甘油培养基，发酵条件优选为在30℃下培养72～120h；所述发酵上清液中杂蛋白含量极少，因此可直接视为抗菌肽原液。本专利技术还提供了所述抗菌肽在制备饲料添加剂中的应用，以及利用所述抗菌肽原液制备的饲料添加剂。本专利技术中，可将所述抗菌肽原液与淀粉混合，获得所述饲料添加剂。当利用重组工程菌B来制备时，可直接取发酵上清液与淀粉混匀，获得所述饲料添加剂。因抗菌肽在pGAPZαA质粒的丙酮酸激酶强启动子作用下，能够实现组成型表达，不需要甲醇诱导，表达产物随菌体增殖而自然累积并分泌至胞外，发酵上清液不含有毒物质甲醇，可直接用于制备饲料添加剂。并且酵母菌本身或其分泌物质中也含有丰富的营养物质，也可直接用于饲喂动物。本专利技术还提供了含有所述饲料添加剂的猪饲料，所述猪饲料是在猪基础日粮中添加0.1～2.0％的饲料添加剂而获得的。利用所述猪饲料对断奶仔猪和育肥猪分别进行饲喂试验，试验结果表明，本专利技术的抗菌肽能够显著提高仔猪的存活率，腹泻率与对照组相比降低了7倍以上，死亡率降低到0％，仔猪日增重的提高和料肉比的降低，均达到差异显著水平。本专利技术的抗菌肽能够显著降低各种致病菌引起的育肥猪腹泻，同时对其他疾病也有预防作用，酵母表达抗菌肽的组死淘率显著低于对照，对各种致病菌引起的腹泻的保护率达到95％-100％，达到0死亡；育肥猪日增重的提高和料肉比的降低也均达到差异显著水平。本专利技术还提供了所述抗菌肽在制备抗感染药物中的应用。试验发现，本专利技术的抗菌肽抗菌谱广、活性高，对包括抗生素抗性菌在内的多种细菌均具有抑杀作用；抗菌肽为20本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种抗菌肽，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。

【技术特征摘要】
1.一种抗菌肽在制备饲料添加剂中的应用，其特征在于，编码所述抗菌肽的碱基序列如SEQIDNo.5所示；所述抗菌肽通过酵母表达系...

【专利技术属性】
技术研发人员：石应辉，徐冬玲，桂向东，李晓祥，
申请(专利权)人：安徽新星生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：安徽;34