(7S)-3,4-二甲氧基双环并[4.2.0]辛-1,3,5-三烯-7-甲酸的酶合成方法以及在伊伐布雷定及其盐的合成中的应用技术

本发明专利技术涉及(7S)-3,4-二甲氧基双环并[4.2.0]辛-1,3,5-三烯-7-甲酸的酶合成方法以及在伊伐布雷定及其盐的合成中的应用，换言之，本发明专利技术涉及酶合成式(I)化合物的方法，还涉及该化合物在伊伐布雷定及其药学上可接受的酸的加成盐的合成中的应用。

【技术实现步骤摘要】
(7S)-3,4-二甲氧基双环并[4.2.0]辛-1,3,5-三烯-7-甲酸的酶合成方法以及在伊伐布雷定及其盐的合成中的应用
本专利技术涉及制药领域。更具体而言，本专利技术涉及酶合成式(I)化合物的方法：还涉及该化合物在式(II)的伊伐布雷定或3-{3-[{[(7S)-3,4-二甲氧基双环并[4.2.0]辛-1,3,5-三烯-7-基]甲基}(甲基)氨基]丙基}-7,8-二甲氧基-1,3,4,5-四氢-2H-3-苯并氮杂-2-酮、其药学上可接受的酸的加成盐及其水合物的合成中的应用：
技术介绍
伊伐布雷定及其与药学上可接受的酸的加成盐(更特别的是其盐酸盐)具有非常有价值的药理学和治疗特性，特别是具有减慢心率的特性，这使得这些化合物可以用于治疗或预防各种心肌缺血疾病，例如心绞痛、心肌梗塞及相关心律失常疾病以及与心律失常有关的各种病理，特别是室上性心律失常疾病和心力衰竭。伊伐布雷定及其药学上可接受的酸的加成盐(特别是其盐酸盐)的制备和治疗用途已经公开于欧洲专利说明书EP0534859。该专利说明书描述了采用式(III)化合物(7S)-1-(3,4-二甲氧基双环并[4.2.0]辛-1,3,5-三烯-7-基)N-甲基甲胺作为起始原料的伊伐布雷定盐酸盐的合成：式(III)化合物是在伊伐布雷定及其药学上可接受的盐的合成中的关键中间体。现有技术公开了获得式(III)化合物多种方法。专利说明书EP0534859描述了通过下列步骤合成式(III)化合物的方法：首先在四氢呋喃中通过BH3还原式(IV)的腈：随后加入盐酸，得到外消旋的式(V)胺的盐酸盐：将其与氯代甲酸乙酯反应，得到式(VI)的氨基甲酸酯：将其通过LiAlH4还原，获得外消旋的式(VII)的甲基化胺：将其采用樟脑磺酸拆分，获得式(III)化合物。该方法采用外消旋的式(IV)的腈制备式(III)化合物的缺点在于收率非常低，仅有2－3%。该非常低的收率是由于式(VII)的仲胺的拆分步骤的收率低(4－%)导致的。专利说明书EP2166004描述了通过下述方法获得式(III)化合物的方法：首先采用手性色谱对外消旋的式(IV)的腈进行光学拆分，获得光学纯的式(IX)的腈：将其采用NaBH4还原或者通过水解的氢还原，获得式(VIII)的伯胺。然后，该伯胺可以采用与上述相同的反应顺序进行甲基化(转化为氨基甲酸酯，然后还原)。因此，采用外消旋的式(IV)的腈作为起始原料，可以通过5步反应获得式(III)化合物，拆分步骤的收率达到45.6%。为了能够采用外消旋的式(IV)的腈作为起始原料直接获得光学纯的式(I)的酸并且从而减少采用外消旋的腈作为原料获得甲基化的式(III)的胺的步骤数目，采用水解的腈水解酶(在酶的国际分类中为EC3.5.5.1)似乎具有很好的前景。式(X)的腈已有报道可以作为获自Almac公司销售的NESK-1400筛选试剂盒的腈水解酶的底物：然而，采用这些相同的腈水解酶显示它们对式(IV)的腈(参考对比实施例A)具有较低的活性并且几乎没有选择性，在大多数情况下导致酰胺(腈水合酶活性)和酸的同时形成，这难以开发出为了获得式(III)化合物合成中所需要的中间体的合成方法。
技术实现思路
因此，本专利技术的目的是发现能够采用外消旋的式(IV)的腈作为原料对映选择性合成光学纯的式(I)的酸同时尽可能减少酰胺形成的腈水解酶。本申请人在各种完整微生物中发现了能够优先形成构型为S的式(I)的酸的腈水解酶活性的证据。在测试的微生物中，只有玫瑰色红球菌(Rhodococcusrhodocrous)能够以良好对映选择性获得(S)酸并且不会形成酰胺(参考对比实施例B)。该活性可以通过腈水解酶的过度表达而提高。令人惊奇的是，采用过度表达的腈水解酶进行的酶的水解对于式(X)的底物没有对映选择性(参考对比实施例C)。更具体地讲，本专利技术涉及合成光学纯的式(I)化合物的方法：该方法采用在另一种具有活性的生物学系统的微生物(例如细菌、酵母菌或真菌)中过度表达的玫瑰色红球菌NCIMB11216的腈水解酶通过外消旋的或非光学纯的式(IV)的腈的对映选择性酶水解进行：该反应在有机溶剂和pH为5－10的水溶液(优选pH5－10的缓冲液)的混合物中进行，每升溶剂混合物中式(IV)的腈的浓度为1－500g/L，优选2－100g/L，E/S的比例为1/1－1/100，反应温度为25℃－40℃。根据本专利技术的一个方面，所述腈水解酶在包含重排质粒的细菌中过度表达，例如大肠杆菌(Escherichiacoli)，优选E.coliBL21(DE3)、E.coliBL21(DE3)pLysS、E.coliBL21star(DE3)或E.coliJM9(DE3)。根据本专利技术的一个方面，所述有机溶剂为与水完全混溶或部分混溶的溶剂，例如二甲基亚砜、DMF、丙酮、乙腈、醇(例如乙醇或异丙醇)或醚(例如THF或MTBE)。根据本专利技术的另一个方面，所述有机溶剂不与水混溶，例如烃类，如庚烷或辛烷。水溶液优选为pH约为7的缓冲液。根据本专利技术的一个方面，所述过度表达腈水解酶的细菌可以直接在工艺过程中使用，以细菌浆液或冻干物的形式使用。在细菌浆液的情况下，所述E/S比例优选自1/1至1/10，在冻干物的情况下，该比例优选为1/10－1/20。根据本专利技术的另一个方面，所述腈水解酶以纯化酶的形式使用。本专利技术的酶水解模式如下：方便的话，构型为(R)的腈(副反应产物)可以通过有机碱(例如DBU)或无机碱(例如氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钾或碳酸钠)的作用从而再循环到酶水解过程中。当外消旋步骤在位进行时，本专利技术的方法为动态动力学拆分(DKR)方法，它使得获得的式(I)的S酸的ee大于98%成为可能。优选在一或多个酶水解循环后，将式(I)酸从反应介质中分离。定义光学纯的化合物应当是指对映体过量百分数大于或等于90%的化合物。非光学纯的腈应当是指对映体过量百分数小于90%的腈。外消旋的腈应当是指比例为55:45－45:55的两种对映体的混合物形式的腈。外消旋的或非光学纯的腈的对映选择性水解应当是指所述对映体混合物中的一种优先水解。活性生物学系统应当是指其基因物质通过基因重组修饰后使其能够产生目标重组蛋白的生物学种属(宿主细胞)。为此目的而构建的表达载体(质粒)可以使得该目标基因的DNA编码可以转移到宿主细胞中，从而可以有效地(过度)表达功能蛋白。本专利技术的另一方面涉及以仅有两个步骤的方法合成式(III)化合物的方法，该方法采用光学纯的式(I)的酸作为原料，将其转化为光学纯的式(XI)的酰胺：将其优选通过BH3、NaBH4或LiAlH4还原，获得式(III)化合物，随后将式(III)化合物与式(XII)化合物进行偶合：其中X代表卤素原子，优选碘原子，或者，在还原剂存在下，将其与式(XIII)化合物进行还原胺化反应：其中R2代表选自CHO和CHR3R4的基团，其中R3和R4每一个均代表直链或支链(C1-C6)烷氧基，或者与携带它们的碳一起形成1,3-二氧六环、1,3-二氧戊环或1,3-二氧庚环，获得伊伐布雷定，然后将其转化为药学上可接受的酸的加成盐，所述盐为无水或水合物形式。在还原胺化反应中，式(III)化合物也可以以其药学上可接受的酸的加成盐形式使用，优选其盐酸盐本文档来自技高网...

【技术保护点】
合成光学纯的式(I)化合物的方法：该方法采用在另一种具有活性的生物学系统的微生物中过度表达的玫瑰色红球菌NCIMB11216的腈水解酶通过外消旋的或非光学纯的式(IV)的腈的对映选择性酶水解进行：该反应在有机溶剂和pH为5－10的水溶液的混合物中进行，每升溶剂混合物中式(IV)的腈的浓度为1－500g，E/S的比例为1/1－1/100，反应温度为25℃－40℃。

【技术特征摘要】
2013.02.28 FR 13517851.合成光学纯的式(I)化合物的方法：该方法采用在另一种具有活性的生物学系统的微生物中过度表达的玫瑰色红球菌NCIMB11216的腈水解酶通过外消旋的或非光学纯的式(IV)的腈的对映选择性酶水解进行：该反应在有机溶剂和pH为5－10的水溶液的混合物中进行，每升溶剂混合物中式(IV)的腈的浓度为1－500g，E/S的比例为1/1－1/100，反应温度为25℃－40℃。2.权利要求1的方法，其中所述具有活性的生物学系统的微生物为包含重排质粒的细菌...

【专利技术属性】
技术研发人员：S·佩德拉戈萨莫罗，F·勒富隆，
申请(专利权)人：瑟维尔实验室，
类型：发明
国别省市：法国;FR