使用辅酶A转移酶的有机酸的制造方法技术

本发明专利技术涉及有机酸的制造方法，是通过以乙酰辅酶A作为底物生物化学地合成有机酸辅酶A，使用辅酶A转移酶在乙酸的存在下进行所述有机酸辅酶A的辅酶A消除反应，来制造有机酸的方法，其中，培养具有以乙酰辅酶A作为底物生成有机酸辅酶A的酶基因群和辅酶A转移酶基因的转化微生物，得到有机酸。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】使用辅酶A转移酶的有机酸的制造方法
本专利技术涉及使用辅酶A转移酶的有机酸类的生物化学制造方法。更详细地说，涉及使用了产生催化有机酸辅酶A的辅酶A消除反应的辅酶A转移酶的转化微生物的、碳收率和能量效率优异的有机酸类的生物化学制造方法。
技术介绍
最近，从化石资源的枯竭和/或地球温暖化对策的观点出发，要求向由可再生资源的化学品制造工艺、所谓生物炼制的转换。特别是对于可以从生物质高效地生物化学获得的各种有机酸类，广泛地研究了作为新一代的化学阻塞(chemicalblock)的应用。例如，羟基羧酸类除了是精密有机化学品的合成原料之外，还是作为已知由微生物蓄积生产的生物聚酯、聚羟基烷酸(PHA)的单体单元已知的有用化合物。特别是关于作为代表性的来源于微生物的PHA的聚-3-羟基丁酸，以其作为生物降解性聚合物的性质受到关注的1980～1990年代为中心，努力地尝试了其生物合成途径的阐明和/或生产性提高。近年来，其构成单元3-羟基丁酸作为化学阻塞(chemicalblock)的将来性再次受到关注，提出了各种3-羟基丁酸单体的生物化学制法。具体地，已知以下方法：提取在微生物菌体内蓄积的聚-3-羟基丁酸，使具有其分解活性的酶或微生物作用，从而进行水解，得到作为单体单元的(R)-3-羟基丁酸的方法(非专利文献1)；在聚-3-羟基丁酸生产菌的活体内，使聚-3-羟基丁酸解聚酶高表达，从而将生成的3-羟基丁酸低聚物依次分解，在培养中获得(R)-3-羟基丁酸的方法(非专利文献2)；对活体内的3-羟基丁酸前体3-羟基丁酰辅酶A，使共表达的磷酸转丁酰基酶(phosphotransbutyrylase，ptb)、丁酸激酶(buk)依次作用，从而通过与磷酸化反应的共轭而消除辅酶，在培养中获得(R)-3-羟基丁酸的方法(非专利文献3)；同样地对3-羟基丁酰辅酶A，使共表达的硫解酶作用而消除辅酶A，在培养中得到3-羟基丁酸的方法(非专利文献4)等。现有技术文献非专利文献非专利文献1:Calabia,B.P.,Tokiwa,Y.,2004.Microbialdegradationofpoly(d-3-hydroxybutyrate)byanewthermophilicStreptomycesisolate.Biotechnol.Lett.26,15-19.非专利文献2:Lee,S.Y.,Lee,Y.,2003.MetabolicengineeringofEscherichiacoliforproductionofenantiomericallypure(R)-(-)-hydroxycarboxylicacids.Appl.Environ.Microbiol.69,3421-3426.非专利文献3:Gao,H.J.,Wu,Q.,Chen,G.Q.,2002.Enhancedproductionofd-(-)-3-hydroxybutyricacidbyrecombinantEscherichiacoli.FEMSmicrobiol.Lett.213,59-65.非专利文献4:Tsengetal.,“MetabolicEngineeringofE.coliforEnhancedProductionof(R)-and(S)-3-Hydroxybutyrate”,2009,Appl.Environ.Microbiol.,75,3137-3145.
技术实现思路
专利技术要解决的课题然而，这些提案的制法的经济性不能说充分，要求生产性的进一步提高。例如，非专利文献1的方法中，需要发酵、提取、分解这样的复杂工序。在非专利文献2的方法中，通过厌氧发酵来生产聚-3-羟基丁酸然后水解，因而生产速度慢。在非专利文献3和4的方法中，碳收率低、3-羟基丁酸的生产性不充分。因此，本专利技术的课题是提供生成速度、碳收率和能量效率优异的有机酸类、特别是3-羟基丁酸单体的生物化学制造方法。用于解决课题的方法本专利技术者们仔细查看了上述非专利文献1～4中记载的见解，以由与辅酶A的共轭而形成的有机酸生物合成途径中的本质的反应效率的提高为目标进行了深入研究。其结果发现，在添加于反应体系内的乙酸的存在下，至少以乙酰辅酶A作为底物生物化学地合成有机酸辅酶A，通过辅酶A转移酶来进行所述有机酸辅酶A的辅酶A消除反应，从而可以有效地提高有机酸类的生产性，从而完成了本专利技术。即，本专利技术涉及以下[1]～[9]所示的有机酸的制造方法。[1]有机酸的制造方法，其特征在于，以乙酰辅酶A作为底物生物化学地合成有机酸辅酶A，使用辅酶A转移酶在乙酸的存在下进行所述有机酸辅酶A的辅酶A消除反应。[2]根据前项1所述的有机酸的制造方法，辅酶A转移酶是丙酰辅酶A转移酶、或其同源物。[3]根据前项1或2所述的有机酸的制造方法，有机酸是碳数3～6的羧酸。[4]根据前项3所述的有机酸的制造方法，有机酸是碳数3～6的羟基羧酸。[5]根据前项4所述的有机酸的制造方法，有机酸是3-羟基丙酸、3-羟基丁酸、3-羟基戊酸、或3-羟基己酸。[6]根据前项1～5的任一项所述的有机酸的制造方法，将转化微生物在乙酸的存在下进行培养，从而得到有机酸，所述转化微生物具有以乙酰辅酶A作为底物而生成有机酸辅酶A的酶基因群和辅酶A转移酶基因。[7]根据前项6所述的有机酸的制造方法，将转化微生物在乙酸的存在下进行培养，从而得到3-羟基丁酸，所述转化微生物具有以乙酰辅酶A作为底物而生成3-羟基丁酰辅酶A的酶基因群和辅酶A转移酶基因。[8]根据前项7所述的有机酸的制造方法，以乙酰辅酶A作为底物而生成3-羟基丁酰辅酶A的酶基因群是β-酮硫解酶基因或其同源物、和乙酰乙酰辅酶A还原酶基因或其同源物，辅酶A转移酶基因是丙酰辅酶A转移酶(PCT)基因或其同源物。[9]根据前项6～8的任一项所述的有机酸的制造方法，微生物是大肠杆菌、酵母、棒状杆菌、或梭菌。专利技术的效果本专利技术提供有机酸的制造方法，该方法是伴有至少以乙酰辅酶A作为底物生物化学地合成的有机酸辅酶A的辅酶A的消除的各种有机酸的制造方法，其中，在添加于反应体系内的乙酸的存在下，使用与有机酸的辅酶A消除反应共轭的乙酸的辅酶A转移反应。根据本专利技术，在由与辅酶A的共轭而形成的有机酸生物合成途径中，活性中间体有机酸辅酶A的自由能，在由与存在于体系内的乙酸的共轭而形成的辅酶A转移反应中，作为乙酰辅酶A而被回收。生成的乙酰辅酶A与有机酸生物合成的原料乙酰辅酶A等价，再次被摄入有机酸生物合成途径中，其自由能在碳骨架延伸反应中被再利用。另外，该过程中供给的乙酸自身也作为有机酸生物合成途径的碳骨架源被利用，从而实现了不发生物质的损失、在生成速度、能量效率和碳收率的任一方面均优异的有机酸的生物化学合成。在本专利技术的方法中，必须在添加于反应体系内的乙酸的存在下进行反应。此外，通常已知在大多微生物中，在其利用糖质等的增殖过程中作为副产物排出乙酸。在本专利技术中，利用这样副产的乙酸作为目的的有机酸合成中的辅酶A转移的供体，进而转移反应所生成的乙酰辅酶A作为有机酸合成的碳骨架被利用，也有助于培养基碳源向目的反应的有效利用。附图说明图1是实施例1所构建的质粒pTV118NpctAB的基因图谱。图2是比较例3所构建的质粒pTV118NAB的基因图谱。图本文档来自技高网...

【技术保护点】
有机酸的制造方法，其特征在于，以乙酰辅酶A作为底物生物化学地合成有机酸辅酶A，使用辅酶A转移酶在乙酸的存在下进行所述有机酸辅酶A的辅酶A消除反应。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2011.10.18 JP 2011-228751;2012.03.21 JP 2012-063091.有机酸的制造方法，其特征在于，以乙酰辅酶A作为底物生物化学地合成有机酸辅酶A，使用辅酶A转移酶在乙酸的存在下进行所述有机酸辅酶A的辅酶A消除反应，所述辅酶A转移酶是丙酰辅酶A转移酶，对转化微生物人为地添加乙酸进行培养，从而得到所述有机酸，所述转化微生物具有以乙酰辅酶A作为底物而生成有机酸辅酶A的酶基因群和辅酶A转移酶基因。2.根据权利要求1所述的有机酸的制造方法，有机酸是碳数3～6的羧酸。3.根据权利要求2所述的有机酸的...

【专利技术属性】
技术研发人员：松本谦一郎，田口精一，青木裕史，
申请(专利权)人：昭和电工株式会社，国立大学法人北海道大学，
类型：发明
国别省市：日本;JP