一种磁性琼脂糖微球的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种磁性琼脂糖微球的制备方法，包括琼脂糖无磁性微球的制备，琼脂糖无磁性微球活化交联，琼脂糖无磁性微球铁离子溶液的制备和化学共转制备磁性琼脂糖微球。本发明专利技术对传统的琼脂糖包覆磁性粒子的方法进行改进，由传统的直接包覆法改进为间接包覆法。本发明专利技术的优势在于，制备出的磁性琼脂糖微球，因内部穿插包覆着磁性四氧化三铁磁芯粒子，极大强度的增加了琼脂糖的机械强度，克服了质地软，结构容易破坏，使用寿命短的缺陷，同时磁性粒子具备超顺磁性，磁响应性强，外加磁场下可实现迅速分离；磁球同传统方法相比，成球性得到改善，球体圆润，不易团聚结块，分散性好，粒径分布均匀，比表面积增大使得分离纯化率提高。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于磁性有机无机复合材料
，具体是涉及。
技术介绍
目前生物医药领域常用的用来进行分离、纯化的材料基质可以分为无机和有机两大类。无机基质的介质主要包括硅胶、多孔玻璃、羟基磷灰石等，多作为高效液相色谱的填充料。有机基质的介质通常为天然多糖、合成高聚物等，这些材料制备成的基质通常为珠球状。通常一种母体结构的基球经过化学修饰可以衍生出具有不同功能基团、不同结构、不同性能、不同种类的分离介质。由此可见，基球是各种分离介质最基础、最重要的“原材料”。由于基球具有多种优良性能，不但是分离介质的母体，还可以作为固定化酶及催化剂的载体等，在生物工程、医药制备乃至电子信息工业等领域都获得了广泛的应用。基球可作为多功能材料，尤其是微米级的微球受到更广泛的应用。琼脂糖是从海藻中提取的一种线性、水溶性天然多糖，是由1，3_连接的β-D-吡喃半乳糖和1，4-连接的3，6-脱水- a -L吡喃半乳糖残基交替连接而成的聚合物。球珠状琼脂糖凝胶具有理想的分离基质特性。琼脂糖凝胶作为基质，有如下优点:①富含羟基，经化学活化后，可偶联各种配基多空网状结构，利于大分子物质在珠体内的扩散，从而增加配基的有效密度具有较好的亲水性，以使生物分子易于靠近并与配体作用，不会使生物分子失活；④不带电荷，非特异性吸附能力极小。在缓冲液离子强度> 0.05mol/L时，对蛋白质几乎没有非特异性吸附。因此，它是分离介质的一种良好的惰性支持物，常被用作亲和色谱法、离子交换色谱法、疏水交换色谱法(HIC)、反相色谱法中的基质，用于分离、纯化等生化领域，例如，Shahab Lahootid 等人(Shahab Lahootid 和 Michael V.Sefton,Effect of an immobilization matrix and capsule permeability on thevariabilityof encapsulated HEK cells, Biomaterials.21 (2000) 987-995)描述了被甲基丙烯酸羟乙酯-甲基丙烯酸甲酯共聚物壳所包围的作为核物质的琼脂糖，其被植入到HEK细胞中。研究表明，琼脂糖有利于植入细胞活性和细胞分裂以及增值。Hiroyuki Hayashi等人(Hiroyuki Hayashij Kazutomo Inouej TunAung 等人,Application of a novel Bcell line MIN6 to amesh -reinforced polyvinyl alcohol hydrogel tube and threelayeragarose microcapsules:An in vitro study，Cell TranspIantation5 (1996)S56-S69)描述了琼脂糖在制备三层凝胶微球中的用途，所述胶囊被用来植入到B细胞线MIN6中。该研究表明，植入的B细胞线MIN6具有比未被植入的MIN6高出两倍的胰岛素分泌速度。目前基质微球的制备方法有多种，主要有悬浮聚合(包括反相悬浮聚合)、乳液聚合、分散聚合、种子溶胀聚合等不同的制备工艺。近十几年又出现了膜乳化-悬浮聚合工艺。琼脂糖作为重要的分离基质，目前最常用的制备方法是反相微乳液法即将琼脂糖热熔于水相中，以具有一定粘度的有机相作为油相，在高温下使热熔的琼脂糖水相分散于有机相中，迅速降温冷却，使琼脂糖凝结成珠球，中国专利CN 1524878A申请了一种反相微乳法制备的琼脂糖微球用于纯化基因工程重组干扰素的技术。中国专利号CN 1472002A申请了一种反相微乳液法制备高通量琼脂糖微球的技术。另一种近几年新兴起的制备方法是反相微乳法-膜乳化法制备琼脂糖微球，即在反相微乳法的基础上，通过压强变化将琼脂糖热熔水相通过特定孔径膜进入有机相中冷却成球，从而更好的控制微球粒径均匀。中国专利号CN 101715364 B申请了反相微乳液-膜乳化法制备琼脂糖多糖球珠的方法。中国专利CN 20041000087.9描述了传统多微孔膜化来制备具有可控粒径的琼脂糖糖珠。上述专利申请制备的琼脂糖微球，只能够作为填充料应用于各种分离柱中来达到分离纯化目的，只能够与各 种色谱仪器配合使用，不可以单独作为基质来达到分离目的。在色谱分离和生物分子净化过程中，分离介质是否能够承受住高流速是一个重要限制，而广泛应用于生物分离领域中的琼脂糖介质相关的某些问题是已知的，琼脂糖凝胶结构是通过氢键的相互作用而形成的。在凝胶态，多糖链将通过链间交错的氢键而形成多空网状结构，这种通过氢键的相互作用而形成凝胶具有低的机械强度，并因此不能经受住非常高的流速，因为颗粒比较软，在层析分离时常常会出现压紧或阻塞层析柱的现象，造成流速过慢，使用寿命短等问题。同时由于仪器使用的限制，增加了操作的复杂性，在进柱前，样品必须经过一系列复杂的前处理，例如需经过细胞破碎、离心分离、盐析沉淀、溶解沉淀等操作步骤，大大增加了分离纯化的难度与时间，加上色谱仪器维护等问题大大提高了操作的成本，并不适合大规模的工业化生产。为了克服琼脂糖凝胶机械强度低的缺点，近年来，有相关报道，在琼脂糖微球中引入磁性物质，以此来作为骨架支撑，增加琼脂糖的机械强度，并可以脱离仪器，通过磁性来单独使用，以实现分离目的。例如，董聿生等人(参考Journal ofNorthwestUniversity (NaturalScience Edition, Apr.2001V0.1 31 N0.2)反相微乳法包覆四氧化三铁制备磁性琼脂糖微球分离尿激酶。李嘉兴等人(参考Chemical Engineering Journal 172 (2011)892 - 897)反相微乳法包覆四氧化三铁吸附放射性核素等。但该方法制备的磁性的琼脂糖微球存在包覆不均匀、包覆效率低、呈球形差，比表面积小等缺点，虽然改善了琼脂糖的机械性能，但同时带来了新的缺陷，如分离纯化虑低，磁响应性差等。
技术实现思路
为了解决上述技术问题，本专利技术对传统的琼脂糖包覆磁性粒子的方法进行改进，由传统的直接包覆法改进为间接包覆法。本专利技术采用如下技术方案: ，包括下述步骤: ①琼脂糖无磁性微球的制备 (1)提供含有添加剂的琼脂糖水溶液作为水相W，在一定温度下加热使琼脂糖溶解，其中琼脂糖在这种溶液中的浓度为0.lwt%-20wt% ； (2)提供与水相W不相混容的有机溶剂作为油相0，并在其中溶解乳化剂，其中油相O中的乳化剂浓度为0.1wt%-1.5wt% ； (3)将油相O加热至在40°C-90°C并且在200-1000rpm的搅拌速度下搅拌，然后将琼脂糖水相W加入到油相O中，保持温度和搅拌速度反应一段时间获得W/Ο乳液；水相W与油相O的体积比为1:1~1000 ； (4)5-10min内降低步骤(3)得到的W/Ο乳液至15~40°C，以形成琼脂糖无磁性微球； ②琼脂糖无磁性微球活化交联 (1)配制氢氧化钠溶液； (2)按照琼脂糖无磁性微球与硼氢化钠质量比1000-10:1称取上述琼脂糖无磁性微球和硼氢化钠，然后加入到氢氧化钠溶液中，琼脂糖无磁性微球与硼氢化钠混合物在氢氧化钠溶液中的浓度0.01~1(^本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种磁性琼脂糖微球的制备方法，包括下述步骤：① 琼脂糖无磁性微球的制备（1）提供含有添加剂的琼脂糖水溶液作为水相W，在一定温度下加热使琼脂糖溶解，其中琼脂糖在这种溶液中的浓度为0.1wt%~20wt%；（2）提供与水相W不相混容的有机溶剂作为油相O，并在其中溶解乳化剂，其中油相O中的乳化剂浓度为0.1wt%~1.5wt%；（3）将油相O加热至在40℃~90℃并且在200~1000rpm的搅拌速度下搅拌，然后将琼脂糖水相W加入到油相O中，保持温度和搅拌速度反应一段时间获得W/O乳液；水相W与油相O的体积比为1:1~1000；（4）5~10min内降低步骤（3）得到的 W/O乳液至15~40℃，以形成琼脂糖无磁性微球；② 琼脂糖无磁性微球活化交联（1）配制氢氧化钠溶液；（2）按照琼脂糖无磁性微球与硼氢化钠质量比1000~10:1称取上述琼脂糖无磁性微球和硼氢化钠，然后加入到氢氧化钠溶液中，琼脂糖无磁性微球与硼氢化钠混合物在氢氧化钠溶液中的浓度0.01~10g/ml，在20~30℃以及300~600rpm下反应10~45min；（3）向步骤（2）的溶液中加入体积比为1:1~100的环氧氯丙烷和二甲基亚砜交联剂混合液，交联剂混合液与步骤（2）的溶液体积比为1:1~100，在20~30℃以及300~600rpm下反应5~20h；（4）洗涤，除去未反应的试剂，得到活化交联的琼脂糖无磁性微球；③ 琼脂糖无磁性微球铁离子溶液的制备（1）配制二价铁离子与三价铁离子混合溶液；（2）将上述活化交联的琼脂糖无磁性微球加入到步骤（1）的混合溶液中，琼脂糖无磁性微球的浓度为0.01~2g/ml，在30~60℃以及200~600rpm下浸泡10~120h；④ 化学共转制备磁性琼脂糖微球（1）按照琼脂糖无磁性微球铁离子溶液与氨水体积比为1~100:1的比例将氨水加入到琼脂糖无磁性微球铁离子溶液中；在40~80℃以及200~1000rpm下通入氮气反应，制备得到四氧化三铁磁芯；（2）在磁场下分离洗涤，保存，得到磁性琼脂糖微球。...

【技术特征摘要】
1.一种磁性琼脂糖微球的制备方法，包括下述步骤: ①琼脂糖无磁性微球的制备 (1)提供含有添加剂的琼脂糖水溶液作为水相W，在一定温度下加热使琼脂糖溶解，其中琼脂糖在这种溶液中的浓度为0.1wt°r20wt% ； (2)提供与水相W不相混容的有机溶剂作为油相O，并在其中溶解乳化剂，其中油相O中的乳化剂浓度为0.1wt0^l.5wt% ； (3)将油相O加热至在40°C~90°C并且在20(T1000rpm的搅拌速度下搅拌，然后将琼脂糖水相W加入到油相O中，保持温度和搅拌速度反应一段时间获得W/0乳液；水相W与油相O的体积比为1:1~1000 ； (4)5^10min内降低步骤(3)得到的W/Ο乳液至15~40°C，以形成琼脂糖无磁性微球； ②琼脂糖无磁性微球活化交联 (1)配制氢氧化钠溶液； (2)按照琼脂糖无磁性微球与硼氢化钠质量比1000-10:1称取上述琼脂糖无磁性微球和硼氢化钠，然后加入到氢氧化钠溶液中，琼脂糖无磁性微球与硼氢化钠混合物在氢氧化钠溶液中的浓度0.01~10g/ml，在20~30°C以及30(T600rpm下反应l(T45min ； (3)向步骤(2)的溶液中加入体积比为1:广100的环氧氯丙烷和二甲基亚砜交联剂混合液，交联剂混合液与 步骤(2)的溶液体积比为1:1~100，在2(T30°C以及30(T600rpm下反应5~20h ； (4)洗涤，除去未反应的试剂，得到活化交联的琼脂糖无磁性微球； ③琼脂糖无磁性微球铁离子溶液的制备 (O配制二价铁离子与三价铁离子混合溶液；...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵九蓬，马丽华，李垚，
申请(专利权)人：哈尔滨工业大学，
类型：发明
国别省市：黑龙江;23