一种定量检测鸡粪中氟喹诺酮类的方法技术

本发明专利技术公开了一种定量检测鸡粪中6种氟喹诺酮类的检测分析方法，该方法包括：(1)鸡粪样品经冷冻干燥；(2)粉碎鸡粪样品并过筛；(3)加入EDTA-Mcllvaine和乙腈混合提取剂，漩涡混匀并超声处理；(4)离心获上清液为提取液；(5)去除有机溶剂后，提取液用滤膜过滤；(6)过滤液过HLB柱并抽干，用5%甲醇溶液清洗柱，最后经甲醇洗脱目标抗生素，收集洗脱液；(7)吹干，用乙腈/0.7%磷酸定容，充分溶解后过滤即可用于定量检测。本发明专利技术方法实现了6种氟喹诺酮类的同时检测，具有低成本、易操作等特点，为复杂基质中FQs类抗生素的检测提供了一种可选的方法，且方法检出限、定量限均低，回收率高。

【技术实现步骤摘要】
一种定量检测鸡粪中氟喹诺酮类的方法
本专利技术涉及一种复杂基质中抗生素的检测方法，具体地说是鸡粪中6种氟喹诺酮类(FQs)抗生素的检测方法。
技术介绍
氟喹诺酮类(FQs)抗生素是一类由人工合成的广谱类抗菌药，是喹诺酮的哌嗪基派生物,通过抑制细菌的DNA解旋酶II(topoisomeraseII)和拓扑异构酶IV(topoisomeraseIV)而影响细菌的DNA复制过程。由于具有广谱抗革兰氏细菌活性和口服吸收效果好等特性，FQs在禽畜养殖业被大量用于禽畜疾病防治以及被用作饲料添加剂。依据世界卫生组织统计，全球每年消耗的抗生素总量中，有90%被用于禽畜养殖。如美国每年养殖业使用抗生素约为1万多吨，由于代谢率仅为10%到40%，大部分抗生素被直接排放到环境中。近年来中国养殖业发展迅猛，规模化、集约化的程度不断提高，每年用于饲料添加剂的抗生素占全球使用量的50%以上。中国每年畜禽粪便产生量约是工业固体废弃物的2倍以上，部分地区甚至超过4倍。大量抗生素将进入环境中而可能导致生物毒性和致病菌产生抗药性基因等环境风险和生态风险。而以欧盟为例，氟喹诺酮类和喹诺酮类作为主要的兽药抗生素，其在欧盟主要国家使用比例仅次于四环素类、磺胺类，由此带来的环境风险不容忽视。而对环境中该类抗生素的检测是评估其环境风险、生态风险的首要步骤，也是对其进行治理的基础环节，因此迫切需要开发一种复杂基质中氟喹诺酮类(FQs)的检测分析方法。由于畜禽粪便基质复杂，FQs分析时受到的杂质干扰大。目前在环境基质中抗生素的检测技术中，高效液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）具有检测范围宽，灵敏度高，较强的抗干扰能力等特点，但由于成本较高而影响到它的广泛应用。而荧光检测器（FLD）成本相对较低而且对于FQs类物质灵敏度较高，因此通过高效液相色谱-荧光分析法（LC/FLD）检测FQs应用越来越多。潘等使用LC/FLD对食品中6种FQs检测分析，Li等使用LC/FLD对土壤中的4种FQs进行残留检测，但回收率相对偏低（洛美沙星为61.3%～67.8%、恩诺沙星63.2%～75.7%）。Zhao等建立了LC-FLD对禽畜粪便中7中FQs同时检测分析的方法，但由于未经过SPE净化过程，方法定量限偏高（0.031～0.15mg/kg）。
技术实现思路
本专利技术的目的是解决复杂基质中FQs不易于分析测定，且现有分析测定技术回收率低、定量限高、成本高等问题，建立了一种基于固相萃取—高效液相色谱荧光检测法，用以分析鸡粪中6种氟喹诺酮类(FQs)：诺氟沙星（NOR）、环丙沙星（CIP）、洛美沙星（LOM）、达氟沙星（DAN）、恩诺沙星（ENR）、沙拉沙星（SAR）。该方法具有较高的回收率，较低的定量限，且分析成本较LC-MS/MS方法低，为复杂基质中FQs的检出提供了一种高效经济的方法，具有较高的推广价值。本专利技术的技术方案是：一种定量检测鸡粪中氟喹诺酮类的方法，包括如下步骤：(1)鸡粪样品经冷冻干燥；(2)粉碎鸡粪样品并过筛；(3)加入EDTA-Mcllvaine和乙腈混合提取剂，漩涡混匀并超声处理；(4)离心获上清液为提取液，重复提取1-3次，合并各次提取液；(5)去除有机溶剂后，提取液用滤膜过滤；(6)过滤液过HLB柱并抽干，用5%甲醇溶液清洗柱，最后经甲醇洗脱目标抗生素，收集洗脱液；(7)吹干，用乙腈/0.7%磷酸定容，充分溶解后过滤即可用于定量检测。上述的方法，所述氟喹诺酮类包括NOR、CIP、LOM、DAN、ENR和SAR六种物质。上述的方法，第(2)步粉碎并过筛是后过2mm筛。第(3)步加入EDTA-Mcllvaine：乙腈=1:1(体积比)的混合提取剂，漩涡混匀30s，超声10-25min，其中混合提取剂为pH≤3.0，优选pH=2，超声提取时间为15min。第(4)步离心获上清液为提取液，重复提取2次，合并3次提取液，其中以3000至5000rpm进行离心。第(5)步去除有机溶剂采用旋转蒸发仪在40℃左右水浴中减压蒸发，提取液用过1.2μm玻璃纤维滤膜。第(6)步的具体步骤是：以1mL/min的速率通过HLB柱并抽干，用6mL5%甲醇溶液清洗柱，最后经5mL甲醇洗脱目标抗生素，收集洗脱液。第(7)步的具体步骤是：在40℃条件下高纯氮气吹干，用体积比为1:9的乙腈/0.7%磷酸定容至1mL，超声5min促溶，过0.22μm滤膜后待测。所述的方法，采用高效液相色谱荧光检测法测定氟喹诺酮类抗生素。所述的方法，所述检测具体操作步骤是：WATERSXterraRP18色谱柱（250mm×4.6mm×5μm,），柱温：40℃；荧光检测器(FLD)检测波长：激发波长280nm,发射波长450nm：进样体积：20μL；流速：0.8ml/min，采用二元梯度泵，流动相A为乙腈，流动相B为0.7%磷酸溶液；梯度洗脱程序：0～20min,10%A；20～35min，10%～25%A；35～45min，40%A；45～55min;10%A。本专利技术采用固相萃取—高效液相色谱荧光检测法分析鸡粪中6种氟喹诺酮类(FQs)，选用Mcllvaine-Na2EDTA缓冲液/乙腈（1:1）（pH=2）作为提取剂，超声提取时间15分钟，经HLB固相柱净化，选用甲醇为洗脱剂，浓缩后用HPLC/FLD检测时应用乙腈/0.7%磷酸（1:9,V/V）为流动相。FQs在0.01～1.0mg/kg浓度范围内呈现良好线性关系，R2为0.9969～0.9999。加标（浓度水平0.01、0.5、1.0mg/kg干重）回收率达76.7%～106.7%，相对标准偏差0.7%～14.4%（n=4）。方法检出限为0.002～0.022mg/kg，方法定量限为0.0068～0.074mg/kg。对FQs类物质从环境样品中提取，提取剂的选择非常重要。目前常用的提取剂有Mg(NO3)2溶液、EDTA-Mcllvaine缓冲液和乙腈等无机有机溶液。比较研究50%Mg(NO3)2-2.5%NH3·H2O、EDTA-Mcllvaine缓冲液(pH=4)和乙腈等无机、有机提取液，甲醇：乙酸：水(6:1:3,V/V)和EDTA-Mcllvaine：乙腈(1:1,V/V)等混合提取液，以及EDTA-Mcllvaine缓冲液与甲醇：乙酸：水(6:1:3,V/V)复合提取时各目标物的回收率后，本专利技术选择EDTA-Mcllvaine：乙腈（1:1）作为提取剂，NOR、CIP、LOM、DAN、ENR和SAR六种物质的回收率分别为83.6%±4.4、68.0%±4.9、74.1%±6.1、79.7%±4.8、90.8%±4.7和64.3%±5.5。氟喹诺酮类抗生素结构式含哌嗪基，有2个pKa值(pKa1=5.5～6.3，pKa2=7.6～8.5)，在水溶液酸性条件下(通常pH<5)，氟喹诺酮是阳离子形式，在对喹诺酮类样品预处理中大多将样品pH调节为酸性，将其转化为阳离子形式有利于提取。在选择EDTA-Mcllvaine：乙腈（1:1）作为提取剂，用HCL或NaOH调节提取液pH为1.0～8.0后对样品进行提取，过SPE柱后上机测定。经对比研究，本专利技术在选择EDTA-Mcllvaine：乙腈=1:1作为提取剂条件下，调节提取剂pH本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种定量检测鸡粪中氟喹诺酮类的方法，其特征在于：(1) 鸡粪样品经冷冻干燥；(2) 粉碎鸡粪样品并过筛；(3) 加入EDTA‑Mcllvaine和乙腈混合提取剂，漩涡混匀并超声处理；(4) 离心获上清液为提取液，重复提取1‑3次，合并各次提取液；(5) 去除有机溶剂后，提取液用滤膜过滤；(6) 过滤液过HLB柱并抽干，用5%甲醇溶液清洗柱，最后经甲醇洗脱目标抗生素，收集洗脱液；(7) 吹干，用乙腈/0.7%磷酸定容，充分溶解后过滤即可用于定量检测。

【技术特征摘要】
1.一种定量检测鸡粪中氟喹诺酮类的方法，其特征在于：(1)鸡粪样品经冷冻干燥；(2)粉碎鸡粪样品并过筛；(3)加入EDTA-Mcllvaine和乙腈混合提取剂，漩涡混匀并超声处理；其中，加入体积比为1:1的EDTA-Mcllvaine：乙腈的混合提取剂，漩涡混匀30s，超声10-25min，其中混合提取剂为pH=2，在40℃条件下超声提取15min；(4)离心获上清液为提取液，重复提取3次，合并3次提取液；(5)去除有机溶剂后，提取液用滤膜过滤；(6)过滤液过HLB柱并抽干，用5%甲醇溶液清洗柱，最后经甲醇洗脱目标抗生素，收集洗脱液；(7)吹干，用乙腈/0.7%磷酸定容，充分溶解后过滤即可用于定量检测；其中，采用高效液相色谱荧光检测法测定氟喹诺酮类抗生素，其检测具体操作步骤是：采用250mm×4.6mm×5μm的WATERSXterraRP18色谱柱，柱温：40℃；荧光检测器检测波长：激发波长280nm，发射波长450nm：进样体积：20μL；流速：0.8ml/min，采用二元梯度泵，流动相A为乙腈，流动相B为0.7%磷酸溶液；梯度洗脱程序：0～20min，10%A；20～35min，10%～25%A；35～...

【专利技术属性】
技术研发人员：薛南冬，刘博，张石磊，李发生，陈宣宇，孟磊，
申请(专利权)人：中国环境科学研究院，
类型：发明
国别省市：北京;11