本发明专利技术属于光谱测量技术领域，涉及一种高空间分辨双轴差动共焦图谱成像方法与装置。本发明专利技术的核心思想是融合双轴差动共焦显微和光谱探测技术，采用分割焦斑差动探测实现几何位置的精密成像，简化了传统差动共焦显微系统的光路结构，继承了双轴显微技术的大视场、大工作距的优势，实现了系统高空间分辨图谱合一的探测。本发明专利技术不仅具有高空间分辨力，还具有三维层析几何成像、光谱探测和微区图谱层析成像三种模式，为微区光谱探测提供了一种新的解决途径，在生物医学、物理材料学等领域有广泛的应用前景。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术属于光谱测量
，涉及一种高空间分辨双轴差动共焦图谱成像方法与装置。本专利技术的核心思想是融合双轴差动共焦显微和光谱探测技术，采用分割焦斑差动探测实现几何位置的精密成像，简化了传统差动共焦显微系统的光路结构，继承了双轴显微技术的大视场、大工作距的优势，实现了系统高空间分辨图谱合一的探测。本专利技术不仅具有高空间分辨力，还具有三维层析几何成像、光谱探测和微区图谱层析成像三种模式，为微区光谱探测提供了一种新的解决途径，在生物医学、物理材料学等领域有广泛的应用前景。【专利说明】高空间分辨双轴差动共焦图谱显微成像方法与装置
本专利技术属于光谱测量
，涉及一种高空间分辨双轴差动共焦图谱显微成像方法与装置，可用于各类样品的三维形貌重构及微区光谱探测。技术背景自从1990年G.J.Puppels等在Nature期刊报道其专利技术共焦拉曼光谱显微技术并成功用于观测单细胞和染色体的形态与组成，共焦拉曼光谱显微技术迅速发展为一种极其重要的样品结构与成分分析的基本手段。该技术既继承了共焦显微术的高分辨层析成像特征，又可以对样品进行光谱分析，因而使激光共焦拉曼光谱显微技术在光谱测试领域独树一帜，并且迅速发展为一种极其重要的样品结构与成分分析的重要手段，使之广泛应用于化学、生物学、医学、物理学、地质学、法庭取证、刑侦学等学科的前沿基础研究中。但是，由于受到“零视场”扫描成像方式和衍射极限的限制，传统共焦显微系统通常难以兼顾分辨能力、工作距离和视场。增大物镜的数值孔径可以改善共焦显微系统的分辨力，但数值孔径的增大反过来又制约了共焦显微系统工作距离的增大及视场范围的扩展。且大数值孔径物镜的尺寸通常在厘米量级，不利于系统的小型化。因而，1994年Stelzer等人提出了双轴共焦显微术，将照明光轴和测量光轴正交放置，对原有共焦显微光路进行了改进，实现了大工作距离、大视场和低数值孔径物镜的高轴向分辨力显微成像，及系统的小型化。传统的激光共焦拉曼光谱仪采用单轴显微系统，导致瑞利散射光光强过大，降低了生物样品的可观测性，根据瑞利散射定则，当入射光与散射光方向垂直时，瑞利散射光强最弱，有利于系统观测高散射性的生物样品。国内外学者利用此特性，提出双轴共焦显微结构并广泛应用于生物领域，取得了一系列成果。例如，1999年，美国Wellman实验室和 Schepens 眼科研究中心的 Webb 和 Rogomentich 在《Confocal microscope with largefield and working distance》中提出了一种使用相对较小数值孔径物镜的双轴共焦显微系统，两个光轴的夹角小于90°，该系统实验光路的工作距离可达20mm，非常适合用于活体细胞学领域；2003年,美国斯坦福大学的Thomas Wang等人在《Dual-axis confocalmicroscope for high-resolution in vivo imaging》中将光纤和MEMS器件引入到双轴共焦显微成像系统中，研制出小型化的三维双轴共焦显微镜，用于高分辨力的医学活体成像；2008年，美国斯坦福大学研究小组研制成功两种规格的双轴共焦显微系统，封装直径分别为IOmm和5_，均可用于对非活体和活体成像。双轴结构的出现为活体样品的探测提供了解决途径，但是现有双轴技术仍不能满足现代科技对光谱探测技术的需求。由于拉曼散射光十分微弱，为了降低拉曼光谱的能量损失，现有共焦拉曼技术中用于焦点定位的针孔尺寸通常较大，直径为150?200 μ m之间，而扩大针孔尺寸则会增加共焦轴向定位曲线的半高宽，降低其定位精度，不能很好的起到定焦作用。但是，现代科技的快速发展对微区光谱探测能力及空间分辨探测能力提出了更高的要求，若要提高空间分辨力及光谱探测能力，必须对系统进行精确定焦。在光学探测系统中，焦点处的测量聚焦光斑尺寸最小，激发光强最强，因此为了获得高空间分辨力和最优的光谱探测能力，必须使测量聚焦光斑位于焦点位置。在差动共焦光路中，要求针孔、探测器中心与测量系统光轴重合，从而保证被测样品反射回的光束可以恰好进入探测器，但是，由于针孔尺寸较小，通常在10 μ m左右，使得针孔调节会有一定困难。另外，差动共焦光路中，两针孔的最优化轴向离焦量与物镜数值孔径N.A.相关，对于光路装调好的针孔位置只适用于特定的物镜N.A.，因而，无法根据样品更换物镜，从而导致差动共焦光路在实际应用中存在较大的局限性。此外，拉曼散射光极其微弱，只有瑞利光束强度的10_3?10_6倍，而现有共焦拉曼光谱探测仪器只利用了微弱的拉曼散射光进行光谱探测而遗弃强于拉曼散射光IO3?IO6倍的瑞利光束，因而，在共焦拉曼光谱探测中如何改善光路结构从而提高拉曼散射光收集效率及利用现有光谱探测系统中遗弃的瑞利光束进行辅助探测是改善共焦拉曼光谱探测技术空间分辨力的新途径。基于上述情况，本专利技术提出双轴差动共焦图谱显微系统，采用双轴方式降低瑞利散射光强度，提高系统空间分辨力；利用现有共焦拉曼光谱探测系统样品散射光中遗弃的瑞利光束构建双轴差动共焦显微成像系统实现样品三维几何位置的高空间分辨成像，利用差动共焦曲线过零点与焦点精确对应这一特性来控制光谱探测器精确捕获焦点处拉曼光谱信息，使其与光谱探测系统有机融合，从而，进行空间位置信息和光谱信息的同时探测，以期实现高空间分辨“图谱合一”成像与探测。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了克服现有共焦拉曼探测仪器中收集效率低、空间分辨力不足，以及不利于对环境背景光、光源强度波动等因素的抑制等缺陷，提出一种具有高空间分辨双轴差动共焦图谱探测方法与装置。本专利技术的目的是通过下述技术方案实现的:本专利技术提出的高空间分辨双轴差动共焦图谱显微成像方法，采用双轴差动共焦的方式对被测样品进行图谱成像，其实现步骤为:I)照明物镜与采集物镜对称分布在测量面法线两侧，并且照明光轴与测量面法线的夹角为Q1，采集光轴与测量面法线的夹角为Θ2，以测量面法线方向为测量轴线，建立系统坐标系(X，y, Ζ),其中Q1=Q2;2)激发光经由照明物镜聚焦到被测样品上，激发出瑞利光和载有被测样品光谱特性的拉曼散射光，轴向即Z向移动被测样品使瑞利光及对应被测样品不同区域的拉曼散射光被反射进入采集物镜，并被采集物镜会聚到二向色分光系统，光束经二向色分光系统分光后，拉曼散射光和瑞利光相互分离，瑞利光被二向色分光系统反射进入差动探测系统，拉曼散射光透射过二向色分光系统进入光谱探测系统获得光谱信号I ( λ ) (λ为波长)；3)对进入差动探测系统的瑞利光进行差动处理，其中，差动探测系统中两个相同的探测系统对称放置于测量光轴两侧，利用针孔横向偏移可使双轴共焦显微系统的轴向响应特性曲线产生相移的特性拟合出相应的差动共焦曲线，并获得差动信号I (X，y, Z, Vxm)，其中Vxm是针孔横向偏移量，利用差动共焦曲线过零点与焦点位置精确对应的特性，通过零点触发来精确捕获激发光斑焦点O位置，实现被测样品的高空间分辨的焦点定位；4)将被测样品移动至焦点O处，重新获取焦点O处的光谱信号I ( λ );5)利用数据处理系统将获得的差动信号I (X，y, ζ, νχΜ)和光谱信号I ( λ )进行数据融合处理，本文档来自技高网...
【技术保护点】
高空间分辨双轴差动共焦图谱显微成像方法，采用双轴差动共焦的方式对被测样品进行图谱成像，其特征在于： 1）照明物镜（2）与采集物镜（7）对称分布在测量面法线（5）两侧，并且照明光轴（4）与测量面法线（5）的夹角为θ1（6），采集光轴（20）与测量面法线（5）的夹角为θ2（37），以测量面法线(5)方向为测量轴线，建立系统坐标系(x,y,z)，其中θ1=θ2； 2）激发光经由照明物镜（2）聚焦到被测样品（3）上，激发出瑞利光和载有被测样品光谱特性的拉曼散射光，轴向即z向移动被测样品（3）使瑞利光及对应被测样品（3）不同区域的拉曼散射光被反射进入采集物镜（7），并被采集物镜（7）会聚到二向色分光系统（8），光束经二向色分光系统（8）分光后，拉曼散射光和瑞利光相互分离，瑞利光被二向色分光系统（8）反射进入差动探测系统（15），拉曼散射光透射过二向色分光系统（8）进入光谱探测系统（19）获得光谱信号I(λ)（λ为波长）； 3）对进入差动探测系统（15）的瑞利光进行差动处理，其中，差动探测系统（15）中两个相同的探测系统（11、12）对称放置于测量光轴（13）两侧，利用针孔横向偏移可使双轴共焦显微系统的轴向响应特性曲线产生相移的特性拟合出相应的差动共焦曲线（27），并获得差动信号I(x,y,z,vxM)，其中vxM是针孔横向偏移量，利用差动共焦曲线过零点与焦点位置精确对应的特性，通过零点触发来精确捕获激发光斑焦点O位置，实现被测样品的高空间分辨的焦点定位； 4）将被测样品（3）移动至焦点O处，重新获取焦点O处的光谱信号I(λ)； 5）利用数据处理系统（21）将获得的差动信号I(x,y,z,vxM)和光谱信号I(λ)进行数据融合处理，以获得样品的位置信息和光谱信息的四维测量信息I(x,y,z,λ)； 6）完成上述步骤后，对被测样品（3）进行横向扫描，即x、y方向，将被测样品（3）移动到下一个点重复步骤2）、3）、4）、5）； 7）单独处理瑞利光的信号时，获得高空间分辨的三维尺度层析图像；单独处理拉曼散射光的信号时，获得光谱图像；同时处理瑞利光和拉曼散射光的信号时，获得高空间分辨的微区图谱层析成像，即 被测样品几何位置信息和光谱信息的“图谱合一” 。...
【技术特征摘要】
...
【专利技术属性】
技术研发人员：赵维谦，崔晗，邱丽荣，王允，
申请(专利权)人：北京理工大学，
类型：发明
国别省市：北京;11
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