多级PCR检测莱姆病的方法和试剂盒技术

本发明专利技术公开了多级PCR检测莱姆病的方法和试剂盒。本发明专利技术方法通过在全封闭体系中，用两对或多对所述病原体特异性引物，通过多级PCR扩增待测样品中的病原体的核酸物质，并通过测序等方法准确地确定病原体的种类或型别。本发明专利技术方法实现了在全封闭体系内、可简便地在多级PCR过程中对各级之间实现PCR扩增产物的按需转移，从而根本上消除了PCR的交叉干扰，使作为临床检测的极度灵敏的、但却又无法广泛实际应用的多级PCR反应，能够在普通医院环境中进行。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物和检测领域，具体地，本专利技术涉及多级PCR检测莱姆病的方法和试剂盒及其应用。 
技术介绍
病原体导致人类或其他动物患病的主要原因。以HPV为例，人乳头瘤病毒是乳头瘤病毒科(Papillomaviridae)的成员，是具有8000bp环状基因组的DNA肿瘤病毒。已知，人乳头瘤病毒(HPV)与某些肿瘤的发病率显示强烈的相关。 HPV在99%宫颈癌病人中可检测到。以流行病学资料为基础，在感染的病人中，不同HPV基因型在形成宫颈癌中不会造成相同的风险水平。根据这些发现基因型可分为低风险、中等风险和高风险等级，除了这些，也存在未分类的基因型。因为风险在很大的范围内变化，并且HPV感染的发病率很高，所以确定基因型极为重要。 该病原体(如病毒)的目前主要检测方法有：特异性PCR(Type-specific PCR)法：该法根据E6、E7基因的变异区设计型特异性的引物进行PCR分析(Walboomers，1999)，其灵敏度大约在几十至数百个HPV拷贝每反应，随HPV型别不同而稍有差异。然而，因为每份样本都需要同时作多份PCR，则导致无法高通量的使用。 PCR是涉及通过多个循环，指数扩增某种多核苷酸序列的技术。PCR技术是众所周知的，并且已经被广泛使用。 PCR技术一般包括以下步骤：变性多核苷酸，然后将至少一对引物寡核苷酸退火到变性的多核苷酸上(使引物与变性的多核苷酸模板杂交)。退火步骤之后，具有聚合酶活性的酶，使用最初的变性多核苷酸作为合成模板，催化合成一条新的掺入了引物寡核苷酸的多核苷酸链。这一系列步骤(变性、引物退火和引物延伸)构成一个PCR循环。 随着循环的重复，新合成的多核苷酸的量指数增加，因为由较早循环新合成的多核苷酸可用作后续循环的合成模板。 DNA的变性一般发生在约90-95℃，引物一般在约40-60℃退火至变性的 DNA，用聚合酶延伸退火的引物的步骤一般在约70-75℃进行。因此，在PCR循环中，必须改变反应混合物(反应体系)的温度，在多循环PCR实验中要多次改变。 PCR技术具有广泛的生物学应用，包括例如，DNA序列分析、探针产生、克隆核酸序列、定位诱变、检测基因突变、诊断病毒感染、分子“指纹分析”和监测生物液体和其他来源中的污染微生物。 然而，在实际应用中，无论的常规PCR反应还是多重PCR反应体系，如果环境或操作过程中引入极少量外源性DNA污染，就可能出现假阳性结果。为了防止污染，一些实验不得不在高度洁净的操作设备或操作室进行。 在PCR反应过程中，各种试验条件控制不当很容易导致扩增失败，降低其灵敏度和特异性。 此外，现有PCR技术能够检测的灵敏度还难以令人满意，尤其是在对含量极低的核酸样品(如仅含1-10个拷贝目标序列的样品)。在活检、尸检样品中检测病原体(如HPV)时，因无关核酸物质的存在，检测灵敏度一直难以提高。 莱姆病是一种常见的最普通的蜱类传播疾病，通过蜱叮咬人类皮肤传播。其病原体为伟氏包柔螺旋体(Borrelia burgdorefi)，在分类学上为螺旋体属的一种，它是一种单细胞的革兰氏阴性螺旋体，传播媒介为硬蜱。症状早期以慢性游走性红斑(ECM)为主，中期表现神经系统及心脏异常，晚期主要是关节炎。 目前本病的特异性诊断包括：血清学检查，如检测特异性抗体IgG和IgM等；和病原学检查，如直接检查和分离培养伯氏疏螺旋体、检测伯氏疏螺旋体独有的DNA序列等。然而，血清学试剂盒测试容易产生假阴性和假阳性结果。而传统的微生物学血培养技术则由于生长周期过长过慢，且病人临床表现千差万别，因此很难用于确诊。 利用PCR方法可以检测伟氏包柔螺旋体(B burgdorferi)DNA包括rRNA基因flaB,recA，p66和质粒携带的ospA基因，作为血清学评估的辅助手段，但这些方法敏感性低，不易确诊。 因此，本领域迫切需要开发一种灵敏度高、特异性好、抗干扰能力强的伟氏包柔螺旋体种类或型别的鉴定方法。 
技术实现思路
本专利技术的目的就是提供一种灵敏度高、特异性好、抗干扰能力强的PCR反应设备和方法。 本专利技术的第一方面，提供了一种鉴别病原体种类或型别的方法，所述方法包括步骤： (a)在封闭的第一级PCR反应腔或隔室中，以含有或可能含有病原体核酸的样本为模板，通过所述病原体特异性的第一引物对进行扩增，从而获得第一扩增产物P1； (b)将第一扩增产物从第一级PCR隔室转移至第二级PCR隔室中，作为第二级PCR的模板，并在封闭的第二级PCR隔室中，通过所述病原体特异性的第二引物对进行扩增，从而获得第二扩增产物P2； (c)任选地，将上一步骤的扩增产物Pi从第i级PCR隔室转移至第i+1级PCR隔室中，作为第i+1级PCR的模板，并在封闭的第i+1级PCR隔室中，通过所述病原体特异性的第i＋1引物对进行扩增，从而获得第i+1扩增产物Pi＋1，其中i为≥2的正整数；本步骤可进行一次或多次； (d)对上一步骤中获得的所述第二扩增产物P2或所述第i＋1扩增产物Pi+1，进行测序，从而获得扩增产物的序列；和 (e)将测得的扩增产物序列与病原体标准序列进行比对，从而鉴别出病原体的种类或型别； 并且，所述病原体为细菌，且所述细菌包括螺旋体目(Spirochaetales)细菌；较佳地，所述的细菌为螺旋体科(Spirochaetes)细菌；更佳地，所述的细菌为疏螺旋体属(Chlamydia)细菌；最佳地，所述的细菌为伟氏包柔螺旋体。 在另一优选例中，在步骤(b)和(c)中，将第j扩增产物Pj从第j级PCR隔室转移至第j＋1级PCR隔室过程中，第j级PCR隔室和第j＋1级PCR隔室都处于封闭状态，其中j为≥1的正整数，并且在第j级PCR隔室和第j＋1级PCR隔室之间设有封闭的或可封闭的连接通道，所述连接通道用于让携带PCR扩增产物的固体颗粒从Pj级隔室(或上游隔室)转移至Pj+1级隔室(或下游隔室)。 在另一优选例中，在步骤(a)、(b)和(c)的整个过程中，所有的PCR隔室都处于封闭状态。 在另一优选例中，在步骤(a)中，第一级PCR隔室中放置有可携带PCR扩增产物的固体颗粒，从而在PCR反应过程中或之后，形成携带PCR扩增产物的固体颗粒。 在另一优选例中，所述的固体颗粒是磁性微球。 在另一优选例中，在步骤(b)和(c)中，利用磁铁或电磁铁，通过所述携带PCR扩增产物的固体颗粒，将第j扩增产物Pj从第j级PCR隔室转移至第j＋1级PCR隔室，其中j为≥1的正整数。 在另一优选例中，所述细菌包括螺旋体目(Spirochaetales)细菌；较佳地，所述的细菌为螺旋体科(Spirochaetes)细菌；更佳地，所述的细菌为疏螺旋体属(Chlamydia)细菌；最佳地，所述的细菌为伟氏包柔螺旋体。 在另一优选例中，被检测的病原体为伟氏包柔螺旋体；并且所述的第一引物对为LD1/LD2。 在另一优选例中，所述的第二引物对为TEC1/LD2本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种鉴别病原体种类或型别的方法，其特征在于，包括步骤：(a)在封闭的第一级PCR反应腔或隔室中，以含有或可能含有病原体核酸的样本为模板，通过所述病原体特异性的第一引物对进行扩增，从而获得第一扩增产物P1；(b)将第一扩增产物从第一级PCR隔室转移至第二级PCR隔室中，作为第二级PCR的模板，并在封闭的第二级PCR隔室中，通过所述病原体特异性的第二引物对进行扩增，从而获得第二扩增产物P2；(c)任选地，将上一步骤的扩增产物Pi从第i级PCR隔室转移至第i+1级PCR隔室中，作为第i+1级PCR的模板，并在封闭的第i+1级PCR隔室中，通过所述病原体特异性的第i＋1引物对进行扩增，从而获得第i+1扩增产物Pi＋1，其中i为≥2的正整数；本步骤可进行一次或多次；(d)对上一步骤中获得的所述第二扩增产物P2或所述第i＋1扩增产物Pi+1，进行测序，从而获得扩增产物的序列；和(e)将测得的扩增产物序列与病原体标准序列进行比对，从而鉴别出病原体的种类或型别；并且，所述病原体为细菌，且所述细菌包括螺旋体目(Spirochaetales)细菌；较佳地，所述的细菌为螺旋体科(Spirochaetes)细菌；更佳地，所述的细菌为疏螺旋体属(Chlamydia)细菌；最佳地，所述的细菌为伟氏包柔螺旋体。...

【技术特征摘要】
2012.12.21 CN 201210564306.01.一种鉴别病原体种类或型别的方法，其特征在于，包括步骤：
(a)在封闭的第一级PCR反应腔或隔室中，以含有或可能含有病原体核酸的样
本为模板，通过所述病原体特异性的第一引物对进行扩增，从而获得第一扩增产物
P1；
(b)将第一扩增产物从第一级PCR隔室转移至第二级PCR隔室中，作为第二级
PCR的模板，并在封闭的第二级PCR隔室中，通过所述病原体特异性的第二引物对
进行扩增，从而获得第二扩增产物P2；
(c)任选地，将上一步骤的扩增产物Pi从第i级PCR隔室转移至第i+1级PCR隔室
中，作为第i+1级PCR的模板，并在封闭的第i+1级PCR隔室中，通过所述病原体特
异性的第i＋1引物对进行扩增，从而获得第i+1扩增产物Pi＋1，其中i为≥2的正整数；
本步骤可进行一次或多次；
(d)对上一步骤中获得的所述第二扩增产物P2或所述第i＋1扩增产物Pi+1，进
行测序，从而获得扩增产物的序列；和
(e)将测得的扩增产物序列与病原体标准序列进行比对，从而鉴别出病原体的
种类或型别；
并且，所述病原体为细菌，且所述细菌包括螺旋体目(Spirochaetales)细菌；
较佳地，所述的细菌为螺旋体科(Spirochaetes)细菌；更佳地，所述的细菌为疏
螺旋体属(Chlamydia)细菌；最佳地，所述的细菌为伟氏包柔螺旋体。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(b)和(c)中，将第j扩增产物
Pj从第j级PCR隔室转移至第j＋1级PCR隔室过程中，第j级PCR隔室和第j＋1级PCR
隔室都处于封闭状态，其中j为≥1的正整数，并且在第j级PCR隔室和第j＋1级PCR
隔室之间设有封闭的或可封闭的连接通道，所述连接通道用于让携带PCR扩增产物
的固体颗粒从Pj级隔室(或上游隔室)转移至Pj+1级隔室(或下游隔室)。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(a)、(b)和(c)的整个过程中，
所有的PCR隔室都处于封闭状态。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(a)中，第一级PCR隔室中放
置有可携带PCR扩增产物的固体颗粒，从而在PCR反应过程中或之后，形成携带

\tPCR扩增产物的固体颗粒。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的固体颗粒是磁性微球。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，在步骤(b)和(c)中，利用磁铁或电
磁铁，通过所述携带PCR扩增产物的固体颗粒，将第j扩增产物Pj从第j级PCR隔室
转移至第j＋1级PCR隔室，其中j为≥1的正整数。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述病原体为细菌，且所述细菌
包括螺旋体目(Spirochaetales)细菌；较佳地，所述的细菌为螺旋体科(Spirochaetes)
细菌；更佳地，所述的细菌为疏螺旋体属(Chlamydia)细菌；最佳地，所述的细
菌为伟氏包柔螺旋体。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(a)、(b)和(c)在多级PCR反应
管中进行，其中所述反应管包括二个或多个可封闭的的PCR反应腔或隔室(10)，并
且在至少两个隔室之间设有封闭的或可封闭的连接通道(40)，所述连接通道用于让
携带PCR扩增产物的固体颗粒(50)从一个隔室(或上游隔室)转移至另一隔室(或下
游隔室)。
9.一种用于特异性扩增病原体的PCR反应系统，所述系统包括：
(i)多级PCR反...

【专利技术属性】
技术研发人员：洪国藩，
申请(专利权)人：中国科学院上海生命科学研究院，
类型：发明
国别省市：上海;31