阳离子水包油乳液制造技术

本发明专利技术涉及阳离子水包油乳液，其含有高浓度阳离子脂质并具有限定的油:脂质比例。所述阳离子脂质可与带负电分子相互作用，从而将所述分子锚定到所述乳液颗粒。本文所述的阳离子乳液可用于递送带负电分子如核酸分子至细胞，并可用于配制基于核酸的疫苗。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】相关申请本申请要求2011年7月6日提交的美国临时申请61/505,109，2011年10月11日提交的美国临时申请61/545,936，和2012年1月11日提交的美国临时申请61/585,641的权益，上述申请各自的全部内容通过引用纳入本文。序列表本申请包含通过EFS-Web以ASCII格式提交的序列表，并通过引用全文纳入本文。所述ASCII副本创建于2012年7月5日，命名为PAT54691.txt，大小为424,203字节。
技术介绍
核酸治疗在治疗从遗传紊乱到获得性病症的疾病中具有前景，所述疾病如癌症、感染性紊乱（AIDS）、心脏病、关节炎、和神经变性疾病（如帕金森病和阿尔茨海默病）。不仅可递送功能基因来修复遗传缺陷或诱导外源基因产物表达，而且还可递送核酸来抑制内源基因表达以提供治疗效果。基因表达的抑制可通过例如反义寡核苷酸、双链RNA（如siRNAs、miRNAs）或核酶来介导。该治疗的关键步骤是体内递送核酸分子到细胞中。然而，体内递送核酸分子，尤其是RNA分子，面临许多技术障碍。首先，由于细胞和血清核酸酶，体内注入的RNA的半衰期仅约70秒（参见例如Kurreck,Eur.J.Bioch.270:1628-44(2003)）。已试图通过使用化学修饰来提高注射RNA的稳定性；然而，数个化学变化的例子导致细胞毒性效果增强或功能丧失或降低。在一个具体示例中，细胞不耐受RNAi双链的剂量，该双链中每个第二磷酸被替换为硫代磷酸酯(Harborth等,Antisense Nucleic Acid Drug Rev.13(2):83-105(2003))。因此，需要开发能体内递送足量核酸分子(尤其是RNA分子)以引起治疗响应，但对宿主没有毒性的递送系统。基于核酸的疫苗是疫苗的诱人替代方案。例如，肌肉内（IM）免疫接种编码抗原的质粒DNA可诱导细胞和体液免疫响应并保护抵御攻击。DNA疫苗比使用蛋白抗原或减毒病原体的传统疫苗具有一些优势。例如，与蛋白疫苗相比，DNA疫苗可更有效地产生具有天然构型的适当折叠抗原和产生细胞免疫响应。DNA疫苗还不具有灭活或减毒病原体相关的一些安全问题。例如，灭活的病毒制剂可包含残留的活病毒，且减毒病毒可变异并回复为致病表型。基于核酸的疫苗的一个限制是通常需要大剂量的核酸以在非人灵长类和人中获得有效的免疫响应。因此，需要递送系统和佐剂来提高基于核酸的疫苗的效力。已开发各种方法用于将核酸分子导入细胞，如磷酸钙转染、聚戊二烯转染、原生质体融合、电穿孔、微注射和脂质转染。阳离子脂质已被配制为脂质体来递送基因到细胞中。此外，已开发阳离子脂质乳液来递送DNA分子到细胞中。参见例如，Kim等，International Journal of Pharmaceutics,295,35-45(2005)。Ott等(Journal of Controlled Release，79卷，1-5页，2002)描述了用阳离子亚微米乳液作为DNA的递送系统/佐剂的方案。该亚微米乳液是基于MF59，一种水佐剂中的有效鲨烯，其是市售批准产品的组分。1,2-二油酰-3-三甲基铵-丙烷(DOTAP)用于促进质粒DNA的胞内递送。Yi等(Pharmaceutical Research,17,314-320(2000))公开了使用豆油和DOTAP为阳离子脂质的阳离子水包油乳液。胆固醇、DOPE和聚合脂质也包括在一些乳液中。所述乳液显示能在最多至90%血清存在下增强DNA的体外转染效率。乳液颗粒的平均粒度在181nm到344nm，且所述粒度在乳液稀释于PBS缓冲液后有增大。Kim等(Pharmaceutical Research，18卷，54-60页，2001)和Chung等(Journal of Controlled Release，71卷，339-350页，2001)描述了用于提高DNA分子体外和体内转染效力的各种水包油乳液。在经测试的阳离子脂质中，就DNA递送而言，DOTAP形成的乳液最稳定、有效。在经测试的油中，鲨烯、轻质矿物油和霍霍巴豆油形成小颗粒的稳定乳液。体外转染的效率显示为与乳液的稳定性相关(例如，100mg/mL的鲨烯和24mg/mL的DOTAP配制的乳液显示高体外转染效率)。乳液的制备首先经混合阳离子脂质和水来形成脂质体悬液(通过超声处理)。脂质体随后被加入油(如鲨烯)中并超声处理混合物以形成水包油乳液。编码抗原或其衍生物的RNA分子也可用作疫苗。RNA疫苗比DNA疫苗具有某些优势。然而，与基于DNA的疫苗相比，基于RNA的疫苗收到的关注相对较少。在作为治疗剂或疫苗给予时，RNA极易被核酸酶降解。此外，RNA不能主动运输到细胞中。参见，例如Vajdy,M.等，Mucosal adjuvants and delivery systemsfor protein-,DNA-and RNA-based vaccines(基于蛋白、DNA和RNA的疫苗的胃肠道外佐剂和递送系统)，Immunol Cell Biol，2004(6):617-27页。因此，需要提供用于核酸分子或其它带负电分子的递送系统。所述递送系统可用于基于核酸的疫苗，尤其是基于RNA的疫苗。
技术实现思路
本专利技术涉及阳离子水包油乳液，其含有高浓度阳离子脂质并具有限定的油:脂质比例。所述油和阳离子脂质是乳液的单独组分，并优选所述油不是离子型的。所述阳离子脂质可与带负电分子相互作用，从而将所述分子锚定到所述乳液颗粒。本文所述的阳离子乳液可用于递送带负电分子如核酸分子(例如编码抗原的RNA分子)至细胞，并可用于配制基于核酸的疫苗。一方面，本专利技术提供一种水包油乳液，其含有分散在水性连续相中的颗粒，其中所述乳液的特征在于：(a)所述颗粒的平均直径在约80nm至180nm；(b)所述乳液含有油和阳离子脂质，其中(i)油:阳离子脂质的比例(摩尔:摩尔)为至少约8:1(摩尔:摩尔)，(ii)所述乳液中阳离子脂质的浓度为至少约2.5mM，且(iii)前提是所述阳离子脂质不是DC-胆固醇。优选地，所述水包油乳液是稳定的。在一些实施方式中，油:阳离子脂质的比例(摩尔:摩尔)是约10:1(摩尔:摩尔)到约43:1(摩尔:摩尔)。所述水包油乳液可含约0.2%-约8%(w/v)的油。在一些实施方式中，所述油是鲨烯或角鲨烷。另一方面，本专利技术提供一种水包油乳液，其含有分散在水性连续相中的颗粒，其中所述乳液的特征在于：(a)所述颗粒的平均直本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种水包油乳液，其含有分散在水性连续相中的颗粒，其特征在于，所述颗粒的平均直径为约80nm到180nm，所述乳液含有油和阳离子脂质，并且其中：(i)油:脂质(摩尔:摩尔)至少约8:1(摩尔:摩尔)；(ii)所述乳液中阳离子脂质的浓度至少约2.5mM；且(iii)所述阳离子脂质不是DC‑胆固醇。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2011.07.06 US 61/505,109;2011.10.11 US 61/545,936;1.一种水包油乳液，其含有分散在水性连续相中的颗粒，其特征在于，所
述颗粒的平均直径为约80nm到180nm，所述乳液含有油和阳离子脂质，
并且
其中：
(i)油:脂质(摩尔:摩尔)至少约8:1(摩尔:摩尔)；
(ii)所述乳液中阳离子脂质的浓度至少约2.5mM；且
(iii)所述阳离子脂质不是DC-胆固醇。
2.如权利要求1所述的水包油乳液，其特征在于，所述颗粒的平均直径为
约80nm到约150nm。
3.如权利要求1或2所述的水包油乳液，其特征在于，所述颗粒的平均直
径为约80nm到约130nm。
4.如权利要求1-3中任一项所述的水包油乳液，其特征在于，所述水包油
乳液是稳定的。
5.如权利要求1-4中任一项所述的水包油乳液，其特征在于，所述油:脂质
的比例(摩尔:摩尔)是约10:1(摩尔:摩尔)到约43:1(摩尔:摩尔)。
6.如权利要求1-5中任一项所述的水包油乳液，其特征在于，所述水包油
乳液含有约0.2%到约8%(w/v)的油。
7.如权利要求1-6中任一项所述的水包油乳液，其特征在于，所述油是鲨
烯或角鲨烷。
8.如权利要求1-7中任一项所述的水包油乳液，其特征在于，所述颗粒还
含有表面活性剂。
9.如权利要求8所述的水包油乳液，其特征在于，所述表面活性剂是非离
子型表面活性剂。
10.如权利要求8或9所述的水包油乳液，其特征在于，所述表面活性剂不
是聚乙二醇(PEG)-脂质。
11.如权利要求8-10中任一项所述的水包油乳液，其特征在于，所述阳离子
水包油乳液含有约0.01%到约2.5%(v/v)的表面活性剂。
12.如权利要求8-11中任一项所述的水包油乳液，其特征在于，所述表面活

\t性剂是SPAN85(失水山梨糖醇三油酸酯)、吐温80(聚山梨酯80)、或其
组合。
13.如权利要求12所述的水包油乳液，其特征在于，所述阳离子水包油乳液
包含约0.5%(v/v)吐温80和约0.5%(v/v)SPAN85。
14.如权利要求1-13中任一项所述的水包油乳液，其特征在于，所述阳离子
脂质的头部基团包括季胺。
15.如权利要求1-13中任一项所述的水包油乳液，其特征在于，所述阳离子
脂质选自下组：1,2-二油酰氧基-3-(三甲基胺基)丙烷(DOTAP)、1,2-二油
酰-sn-甘油-3-乙基磷酸胆碱(DOEPC)、N,N-二油酰-N,N-二甲基氯化铵
(DODAC)、和N-[1-(2,3-二油烯氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化铵
(DOTMA)。
16.如权利要求15所述的水包油乳液，其特征在于，所述阳离子脂质是
DOTAP。
17.如权利要求16所述的水包油乳液，其特征在于，所述乳液中的DOTAP
浓度是至少约2.58mM(1.8mg/mL)。
18.如权利要求16所述的水包油乳液，其特征在于，所述乳液中的DOTAP
浓度是约2.58mM(1.8mg/mL)到约7.16mM(5mg/mL)。
19.制备权利要求1-18中任一所述的水包油乳液的方法，所述方法包括：(a)
直接将阳离子脂质溶解在油中以形成油相；(b)提供所述乳液的水相；和
(c)通过均质化将所述油相分散在所述水相中。
20.如权利要求19所述的方法，其特征在于，步骤(a)还包括加热所述油至温
度在约30℃到约65℃之间。
21.一种组合物，其包含与阳离子水包油乳液颗粒复合的RNA分子，其特征
在于，所述颗粒包括在25℃时为液相的油，和阳离子脂质，其中：
(i)油:脂质的比例(摩尔:摩尔)至少约8:1(摩尔:摩尔)；
(ii)所述乳液中阳离子脂质的浓度至少约1.25mM；且
(iii)所述阳离子脂质不是DC-胆固醇。
22.如权利要求21所述的组合物，其特征在于，所述颗粒的平均直径为约80
nm到约180nm。
23.如权利要求21所述的组合物，其特征在于，所述颗粒的平均直径为约80

\tnm到约150nm。
24.如权利要求21所述的组合物，其特征在于，所述颗粒的平均直径为约80
nm到约130nm。
25.如权利要求21-24中任一项所述的组合物，其特征在于，所述组合物的
N/P比至少约4:1。
26.如权利要求21-24中任一项所述的组合物，其特征在于，所述乳液的N/P
比为约4:1到约20:1。
27.如权利要求21-24中任一项所述的组合物，其特征在于，所述乳液的N/P
比为约4:1到约15:1。
28.如权利要求21-27中任一项所述的组合物，其特征在于，所述油:脂质的
比例(摩尔:摩尔)是约10:1(摩尔:摩尔)到约43:1(摩尔:摩尔)。
29.如权利要求21-28中任一项所述的组合物，其特征在于，所述阳离子水
包油乳液包含约0.1%-约5%(w/v)的油。
30.如权利要求29所述的组合物，其特征在于，所述油是鲨烯或角鲨烷。
31.如权利要求21-30中任一项所述的组合物，其特征在于，所述颗粒还包
含表面活性剂。
32.如权利要求31所述的组合物，其特征在于，所述表面活性剂是非离子型
表面活性剂。
33.如权利要求31或32所述的组合物，其特征在于，所述表面活性剂不是聚乙
二醇(PEG)-脂质。
34.如权利要求31-33中任一项所述的组合物，其特征在于，所述阳离子水
包油乳液包含约0.005%到约1.25%(v/v)的表面活性剂。
35.如权利要求31-33中任一项所述的组合物，其特征在于，所述表面活性
剂是SPAN85(失水山梨糖醇三油酸酯)、吐温80(聚山梨酯80)、或其组
合。
36.如权利要求35所述的组合物，其特征在于，所述阳离子水包油乳液包含
约0.25%(v/v)吐温80和约0.25%(v/v)SPAN85。
37.如权利要求21-36中任一项所述的组合物，其特征在于，所述阳离子脂
质的头部基团包括季胺。
38.如权利要求21-36中任一项所述的组合物，其特征在于，所述阳离子脂

\t质选自下组：1,2-二油酰氧基-3-(三甲基胺基)丙烷(DOTAP)、1,2-二油酰
-sn-甘油-3-乙基磷酸胆碱(DOEPC)、N,N-二油酰-N,N-二甲基氯化铵
(DODAC)、和N-[1-(2,3-二油烯氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化铵
(DOTMA)。
39.如权利要求38所述的组合物，其特征在于，所述阳离子脂质是DOTAP。
40.如权利要求39所述的组合物，其特征在于，所述组合物中的DOTAP浓
度是至少约1.29mM(0.9mg/mL)。
41.如权利要求39所述的组合物，其特征在于，所述组合物中的DOTAP浓
度是约1.29mM(0.9mg/mL)到约3.58mM(2.5mg/mL)。
42.如权利要求21-41中任一项所述的组合物，其特征在于，所述RNA分子
是编码抗原的自复制RNA分子。
43.如权利要求42所述的组合物，其特征在于，所述自复制RNA是α病毒
衍生的RNA复制子。
44.一种制备组合物的方法，所述组合物包含与阳离子水包油乳液的颗粒复
合的RNA分子，所述方法包括：
(i)提供权利要求1-18中任一项所述的水包油乳液；
(ii)提供含有所述RNA分子的水溶液；以及
(iii)组合(i)的水包油乳液和(ii)的水溶液，从而制备所述组合物。
45.如权利要求44所述的方法，其特征在于，(i)的所述阳离子水包油乳液和
(ii)的所述RNA溶液以约1:1(v/v)的比例组合。
46.如权利要求44或45所述的方法，其特征在于，包含所述RNA分子的水
溶液含有盐。
47.如权利要求46所述的方法，其特征在于，所述盐是NaCl。
48.如权利要求47所述的方法，其特征在于，所述水溶液包含约20mM NaCl。
49.如权利要求44-48中任一项所述的方法，其特征在于，包含所述RNA分
子的水溶液是缓冲液。
50.如权利要求49所述的方法，其特征在于，所述缓冲液是柠檬酸盐缓冲液。
51.如权利要求50所述的方法，其特征在于，所述缓冲液包含约2mM柠檬
酸盐。
52.如权利要求44-51中任一项所述的方法，其特征在于，包含所述RNA分

\t子的水溶液包含非离子型等张剂。
53.如权利要求52所述的方法，其特征在于，所述非离子型等张剂是糖或糖
醇。
54.如权利要求53所述的方法，其特征在于，所述非离子型等张剂选自下组：
蔗糖、海藻糖、山梨糖醇、右旋糖和其组合。
55.如权利要求52所述的方法，其特征在于，所述非离子型等张剂是蔗糖。
56.如权利要求55所述的方法，其特征在于，所述水溶液包含约560mM蔗
糖。
57.如权利要求44-56中任一项所述的方法，其特征在于，包含所述RNA分
子的水溶液包含聚合物。
58.如权利要求57所述的方法，其特征在于，所述聚合物是F127。
59.如权利要求57或58所述的方法，其特征在于，所述水溶液包含约0.05%
到约20%(w/v)的聚合物。
60.如权利要求57-59中任一项所述的方法，其特征在于，所述水溶液包含
约1%(w/v)F127。
61.一种水包油乳液，其含有分散在水性连续相的颗粒，其特征在于，所述
乳液含有油和阳离子脂质，所述颗粒的平均直径从约80nm到180nm，
所述油以0.6%至4%(w/v)存在；且所述乳液中阳离子脂质的浓度至少约
1.25mM。
62.如权利要求61所述的水包油乳液，其特征在于，所述水包油乳液是稳定
的。
63.如权利要求61或62所述的水包油乳液，其特征在于，所述乳液中的阳
离子脂质浓度至少约2.5mM。
64.如权利要求61-63中任一项所述的水包油乳液，其特征在于，所述油是
鲨烯或角鲨烷。
65.如权利要求61-64中任一项所述的水包油乳液，其特征在于，所述颗粒
还含有表面活性剂。
66.如权利要求65所述的水包油乳液，其特征在于，所述表面活性剂是非离
子型表面活性剂。
67.如权利要求66所述的水包油乳液，其特征在于，所述表面活性剂不是聚

\t乙二醇(PEG)-脂质。
68.如权利要求65-67中任一项所述的水包油乳液，其特征在于，所述阳离
子水包油乳液含有约0.01%到约2.5%(v/v)的表面活性剂。
69.如权利要求65-68中任一项所述的水包油乳液，其特征在于，所述表面
活性剂是SPAN85(失水山梨糖醇三油酸酯)、吐温80(聚山梨酯80)、或
其组合。
70.如权利要求61-69中任一项所述的水包油乳液，其特征在于，所述阳离
子脂质的头部基团包括季胺。
71.如权利要求61-69中任一项所述的水包油乳液，其特征在于，所述阳离
子脂质选自下组：1,2-二油酰氧基-3-(三甲基胺基)丙烷(DOTAP)、1,2-二
油酰-sn-甘油-3-乙基磷酸胆碱(DOEPC)、N,N-二油酰-N,N-二甲基氯化铵
(DODAC)、和N-[1-(2,3-二油烯氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化铵
(DOTMA)。
72.如权利要求71所述的水包油乳液，其特征在于，所述阳离子脂质是
DOTAP。
73.一种组合物，其包含与权利要求61-72中任一项所述的阳离子水包油乳
液的颗粒复合的RNA分子。
74.如权利要求73所述的组合物，其特征在于，所述组合物的N/P比至少约
4:1。
75.如权利要求73所述的组合物，其特征在于，所述组合物的N/P比为约4:1
到约20:1。
76.如权利要求73所述的组合物，其特征在于，所述组合物的N/P比为约4:1
到约15:1。
77.如权利要求73-76中任一项所述的组合物，其特征在于，所述RNA分子
是编码抗原的自复制RNA分子。
78.如权利要求77所述的组合物，其特征在于，所述自复制RNA是α病毒
衍生的RNA复制子。
79.如权利要求73-78中任一项所述的组合物，其特征在于，所述乳液颗粒
的平均直径为约80nm到约180nm。
80.如权利要求21-43和73-79中任一项所述的组合物，其特征在于，所述组

\t合物经缓冲且pH为约6.0-约8.0。
81.如权利要求21-43和73-80中任一项所述的组合物，其特征在于，所述组
合物还包含无机盐，且无机盐浓度不超过30mM。
82.如权利要求21-43和73-81中任一项所述的组合物，其特征在于，所述组合
物还包含非离子型等张剂并且为等渗的。
83.如权利要求1-20中任一项所述的水包油乳液，其特征在于，所述水包油
乳液是稳定的。
84.一种组合物，其包含与阳离子水包油乳液的颗粒复合的RNA分子，其特
征在于，所述组合物用下述过程制得：
(i)提供权利要求61-72中任一项所述的水包油乳液；
(ii)提供含有所述RNA分子的水溶液；以及
(iii)组合(i)的水包油乳液和(ii)的水溶液，从而制备所述组合物。
85.如权...

【专利技术属性】
技术研发人员：L·布里托，M·陈，A·吉尔，德里克·奥黑根，M·辛格，
申请(专利权)人：诺华股份有限公司，
类型：发明
国别省市：瑞士;CH