工程化破囊壶菌属微生物制造技术

本发明专利技术尤其提供破囊壶菌以及相关方法和试剂，包括来自破囊壶菌属或破囊壶菌和/或在破囊壶菌属或破囊壶菌中可操作的工程化调控序列、适用于工程化微生物例如破囊壶菌属的选择性标记、使微生物突变的方式、通过突变诱发产生的新型菌株、以及在微生物中产生与特定化合物有关的方法和组合物。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】工程化破囊壶菌属微生物相关申请的交叉引用本申请要求2011年3月7日提交的美国临时申请序列号61/449，848的权益和优先权，其全部内容以全文引用的方式并入本文中。序列表本说明书参考如国际申请在提交时所公开的序列表(标题为“Sequence_Listing.txt”，在2012年3月7日创建，并且为108千字节)。所述序列表的全部内容以引用的方式并入本文中。
本专利技术涉及可以提供有用的化合物和试剂来源的经过基因改造的破囊壶菌属类。专利技术背景多不饱和脂肪酸(PUFA)长久以来被认为对健康具有有益影响。营养补充物的主要来源是来自具有高浓度PUFA的例如鍉鱼、沙丁鱼、鲑鱼、鲱鱼、鲭鱼和金枪鱼等鱼类物种的油。然而，来源缺乏可靠性，并且从鱼类分离得到的PUFA的质量和/或数量具有可变性，这意味着对PUFA的替代性来 源仍存在需要。破囊壶菌属类是水生的真核微生物，其有能力产生有用的产物，包括PUFA和抗氧化剂(Carmona 等人，Biosc1.Biotechnol.Biochem.67 (4):884-888，2003)。这些生物体在世界各地的海洋和河口中均有发现。破囊壶菌属类能够利用广泛各种碳源和氮源来生长，从而表明一种利用廉价营养物进行工业化培养的潜力。对改进的PUFA来源和其他有用的化合物仍存在需要。专利技术概要本专利技术涵盖利用可用的PUFA来源和其他有用的化合物和试剂来认识某些问题。本专利技术涵盖如下认知:不论是通过传统的突变诱发还是以别的方式而被基因改造的破囊壶菌属类可以提供有用的PUFA来源和其他化合物和试剂。在多种实施方案中，本专利技术提供用于对破囊壶菌属类进行基因工程化的系统，以及具有多种用途(例如产生PUFA和/或产生生物燃料)的基因工程化破囊壶菌属类。在某些实施方案中，本专利技术提供分离的核酸分子，其包含破囊壶菌属或破囊壶菌基因元件，例如破囊壶菌属或破囊壶菌启动子或终止子。所提供的分离的核酸分子中的示例性启动子包括(但不限于)微管蛋白(tubulin)启动子(例如与SEQ ID N0:6或SEQ IDNO: 10具有至少80%、85%、90%、92%、95%、97%、98%、99%或更高序列一致性的核酸序列)、Δ 5延伸酶(elongase)启动子(例如与SEQ ID NO: 19具有至少80%序列一致性的核酸序列)和Λ4 去饱和酶(desaturase)启动子(例如与 SEQIDN0:24 具有至少 80%、85%、90%、92%、95%、97%、98%、99%或更高序列一致性的核酸序列)。所提供的分离的核酸分子中的示例性终止子包括(但不限于)微管蛋白终止子(例如与SEQ ID NO: 14或SEQ ID NO: 16具有至少80%、85%、90%、92%、95%、97%、98%、99%或更高序列一致性的核酸序列)。在一些实施方案中，提供分离的核酸分子，其包含可操作地连接到破囊壶菌属或破囊壶菌基因启动子和破囊壶菌属或破囊壶菌基因终止子的异源序列。在一些实施方案中，所述异源序列编码多肽。在一些实施方案中，所提供的分离的核酸分子进一步包含希奥辛(zeocin)抗性基因。在某些实施方案中，提供宿主细胞，其包含一种或多种所提供的分离的核酸。在某些实施方案中，提供诱使微生物(例如破囊壶菌属或破囊壶菌)细胞突变的方法，包括以下步骤:在培养基上培养所述微生物细胞，所述培养基包含希奥辛并且希奥辛浓度能杀死60-80%的所述细胞；以及分离在培养中存活下来的细胞亚群，从而使微生物细胞突变。在某些实施方案中，提供破囊壶菌属或破囊壶菌细胞，其含有对编码与破囊壶菌属或破囊壶菌的PUFA生物合成途径有关的酶多肽或酶多肽复合物的部分的一个或多个基因的一种或多种修饰。在一些实施方案中，当在可比条件下培养经过修饰的细胞和参考细胞时，相较于参考破囊壶菌属或破囊壶菌细胞，所述一种或多种修饰使经过修饰的细胞产生的一种或多种PUFA增加。在一些实施方案中，所述酶多肽或酶多肽复合物选自由以下组成的组:脂肪酸合酶(FAS)、Λ 5延伸酶、Λ 12延伸酶、Λ 4去饱和酶以及聚酮PUFA合酶(PKS)。在一些实施方案中，所述一种或多种PUFA选自由以下组成的组:α -亚麻酸(“ALA”)、花生四烯酸(“ARA”)、二十二碳六烯酸(“DHA”)、二十二碳五烯酸(“DPA”)、二十碳五烯酸(“EPA”)、Y-亚麻酸(“GLA”)以及亚油酸(“LA”)。在一些实施方案中，所述酶或酶复合物选自由以下组成的组:聚酮PUFA合酶(PKS)、Λ 9去饱和酶、延伸酶以及ω-3去饱和酶。在某些实施方案中，提供使破囊壶菌属或破囊壶菌细胞转化的方法，包括以下步骤:(a)提供感受态(competent)破囊壶菌属或破囊壶菌细胞；(b)将重组核酸递送到所述感受态破囊壶菌属或破囊壶菌细胞中，其中所述重组核酸包含选择性标记；以及(C)在含有选择剂的培养基中培养所述感受态破囊壶菌属或破囊壶菌细胞，所述选择剂能在无所述选择性标记存在下减少细胞的生长。在一些实施方案中，所述选择性标记是抗生素抗性基因。在一些实施方案中，所述选择剂是抗生素。例如，所述抗生素可以是希奥辛。在一些实施方案中，希奥辛是以大于50 μ g/mL (例如约100 μ g/mL)的浓度存在。在所提供的使破囊壶菌属或破囊壶菌细胞转化的方法的一些实施方案中，重组核酸进一步包含不同于所述选择性标记的基因表达盒。在一些实施方案中，所提供的使破囊壶菌属或破囊壶菌细胞转化的方法进一步包括以下步骤:分离含有所述选择性标记的感受态破囊壶菌属或破囊壶菌细胞。在一些实施方案中，所述递送步骤包括:生物弹射式递送(biolistic delivery)涂有所有重组核酸的粒子。例如，包含金粒子的粒子可以用于生物弹射式递送中。在一些实施方案中，所述培养基含有介于较低盐浓度与较高盐浓度之间的盐含量。在一些实施方案中，较低浓度是约1、约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约12、约15、约17、约18、约19g/L或约20g/L。在一些实施方案中，较高盐浓度是约20、约22、约25、约27、约30、约32、约35、约37、约40、约45、约50、约55、约60、约65g/L或约70g/L。在一些实施方案中，盐浓度是介于约3g/L与约70g/L之间；介于约5g/L与约60g/L之间；介于10g/L与约40g/L的盐之间(例如介于约15g/L与约35g/L的盐之间，或介于约18g/L与约35g/L的盐之间；或介于约9g/L与约18g/L之间)。在一些实施方案中，所述盐是或包含选自以下的盐:钠盐(例如海盐、氯化钠、食盐(table salt)、硫酸钠等)、钾盐以及其组合。在一些实施方案中，所述盐是或包含非氯盐。在一些实施方案中，所述盐是或包含非氯化物的钠盐 。在某些实施方案中，提供遗传转化感受态破囊壶菌属或破囊壶菌细胞。在某些实施方案中，提供已用重组核酸转化的破囊壶菌属或破囊壶菌细胞。在某些实施方案中，提供培养破囊壶菌属或破囊壶菌细胞的方法，所述方法包括:使包含破囊壶菌属或破囊壶菌细胞的培养物在第一组条件下生长，在所述第一组条件下生物质发生增加(并且任选地，其他特征也发生增加或减少)；将所述第一组培养条件改变成第二组条本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种分离的核酸分子，其包含破囊壶菌基因启动子。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2011.03.07 US 61/449,8481.一种分离的核酸分子，其包含破囊壶菌基因启动子。2.根据权利要求1所述的核酸分子，其中所述启动子是微管蛋白启动子。3.根据权利要求2所述的核酸分子，其中所述启动子的核苷酸序列与SEQID N0:6至少80%—致。4.根据权利要求2所述的核酸分子，其中所述启动子的核苷酸序列与SEQID N0:10至少80%—致。5.根据权利要求1所述的核酸分子，其中所述启动子是A5延伸酶启动子。6.根据权利要求5所述的核酸分子,其中所述启动子的核苷酸序列与SEQID NO: 19至少80%—致。7.根据权利要求1所述的核酸分子，其中所述启动子是A4去饱和酶启动子。8.根据权利要求7所述的核酸分子，其中所述启动子的核苷酸序列与SEQID NO:24至少80%—致。9.一种分离的核酸分子，其包含破囊壶菌基因终止子。10.根据权利要求9所述的核酸分子，其中所述终止子是微管蛋白终止子。11.根据权利要求9所述的核酸分子，其中所述终止子的核苷酸序列与SEQID NO: 14至少80% —致。12.根据权利要求9所述的核酸分子,其中所述终止子的核苷酸序列与SEQID NO: 16至少80% —致。13.一种分离的核酸分子，其包含可操作地连接到破囊壶菌基因启动子和破囊壶菌基因终止子的异源序列。14.根据权利要求13所述的分离的核酸分子，其中所述异源序列编码多肽。15.根据权利要求13所述的分离的核酸分子，其进一步包含希奥辛抗性基因。16.一种宿主细胞，其包含根据权利要求13到15中任一项所述的核酸分子。17.一种诱使微生物细胞突变的方法，所述方法包括: 在培养基上培养所述微生物细胞，所述培养基包含希奥辛并且希奥辛浓度能杀死60-80%的所述细胞； 分离在培养中存活下来的细胞亚群，从而使微生物细胞突变。18.—种破囊壶菌细胞，其含有对编码与破囊壶菌的PUFA生物合成途径有关的酶多肽或酶多肽复合物的部分的一个或多个基因的一种或多种修饰。19.根据权利要求18所述的细胞，其中当在可比条件下培养经过修饰的细胞和参考细胞时，相较于参考破囊壶菌细胞，所述一种或多种修饰使所述经过修饰的细胞产生的一种或多种PUFA增加。20.根据权利要求19所述的细胞，其中所述酶多肽或酶多肽复合物选自由以下组成的组:脂肪酸合酶(FAS)、A 5延伸酶、A 12延伸酶、A 4去饱和酶以及聚酮PUFA合酶(PKS)。21.根据权利要求19所述的细胞，其中所述一种或多种PUFA选自由以下组成的组:花生四烯酸(ARA)、二十二碳六烯酸(DHA)、二十二碳五烯酸(DPA)、二十碳五烯酸(EPA)、Y-亚麻酸(GLA)、亚油酸(LA)以及亚麻酸。22.根据权利要求18所述的细胞，其中所述酶或酶复合物选自由以下组成的组:聚酮PUFA合酶(PKS)、A 9去饱和酶、延伸酶以及《-3去饱和酶。23.一种使破囊壶菌细胞转化的方法，包括以下步骤: (a)提供感受态破囊壶菌细胞； (b)将重组核酸递送到所述感受态破囊壶菌细胞中，其中所述重组核酸包含选择性标记；以及 (c)在含有选择剂的培养基中培养所述感受态破囊壶菌细胞，所述选择剂能在无所述选择性标记存在下减少细胞的生长。24.根据权利要求23所述的方法，其中选择性标记是抗生素抗性基因。25.根据权利要求24所述的方法，其中选择剂是抗生素。26.根据权利要求25所述的方法，其中抗生素是希奥辛。27.根据权利要求26所述的方法，其中所述希奥辛是以大于50μg/mL的浓度存在。28.根据权利要求27所述的方法，其中所述希奥辛是以约100ug/mL的浓度存在。29.根据权利要求23所述的方法，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：S张，R阿门塔，
申请(专利权)人：DSM营养产品股份公司，
类型：
国别省市：