具有来自IFNα2的SAR元件的表达系统技术方案

来自人干扰素α2基因SAR3区域的短的人基因组核苷酸序列可容许在没有药物选择的情况下增强表达稳定性，并容许产生用于产生重组蛋白的稳定克隆或稳定细胞池。虽然可以产生稳定克隆，但是产生稳定的池的能力会减少产生稳定克隆的负担。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】具有来自IFNα2的SAR元件的表达系统相关专利申请的交叉引用本申请要求2011年4月13日提交的美国临时专利申请USSN61/474,879的权益，所述申请的全部内容以引用的方式纳入本文。
本专利技术涉及用于增强蛋白表达的多核苷酸以及涉及包含所述多核苷酸的表达系统。
技术介绍
哺乳动物细胞中高水平和稳定的重组蛋白（r-蛋白）生产对于具有成本效益的生物治疗剂制造是重要的。S/MAR（支架/基质附着区）是富含AT（70%）的序列，其被认为在染色质功能中起到许多重要作用。除了其结构功能外，S/MAR在基因表达的时间和空间组织上起重要作用（Alvarez2000;Liu1997）。因此，在表达载体中包括S/MAR序列可以帮助提高表达水平并防止转基因的沉默（Phi-Van1990;Jenke2004;Zahn-Zabal2001;Kim2004）。已经证明MAR元件可在整合到宿主基因组后或作为附加型载体的一部分起作用（Halweg2005;Girod2005）。基因组元件例如UCOE（来自Millipore）或MAR（来自Selexis）是可以利用的，并且已经证实当在用于产生稳定细胞系的表达载体中以顺式或反式提供所述元件时可增强表达水平和稳定性。在人基因组中存在可被纳入到表达载体用于增强克隆细胞系的生产力和稳定性的许多S/MAR（Girod2007）。但是，这些序列并没有全部都显示出有益的效果（Sass2005）并且这些序列经常非常大（1.5-4kb），因此将其纳入到表达载体中是不实际的。需要鉴定短的（<1kb）且仍然有效的S/MAR序列，但是实现这一目的的唯一方式是试错法。
技术实现思路
现已发现来自人干扰素α2基因的SAR3区域的短的人基因组核苷酸序列可容许在没有药物选择的情况下增强表达稳定性，并容许产生用于产生重组蛋白的稳定克隆或稳定细胞池。虽然可以产生稳定克隆，但是产生稳定细胞池的能力减轻了产生稳定克隆的负担。因此，在本专利技术的一方面中，提供了分离的多核苷酸，其包含不多于755个核苷酸并且包含来自SEQIDNO:1所示核苷酸序列的至少500个连续的核苷酸。在本专利技术的另一方面中，提供了用于在宿主细胞中产生重组蛋白的表达系统，其包括：编码目的蛋白的基因；用于操纵所述表达系统的核苷酸序列；和，以顺式方式纳入所述表达系统中用于增强所述基因表达的表达增强子，所述表达增强子包含来自人干扰素α2上游支架附着区3（SAR3）的核苷酸序列，其包含不多于755个核苷酸并且包含来自SEQIDNO:1所示核苷酸序列的至少500个连续的核苷酸。在本专利技术的另一方面中，提供了包含本专利技术的表达系统的宿主细胞。在本专利技术的另一方面中，提供了一种产生重组蛋白的方法，其包括：用本专利技术的表达系统转染宿主细胞；在适于表达所述基因的条件下培养所述宿主细胞以产生所述目的蛋白；和，回收所述目的蛋白。在本专利技术的另一方面中，提供了本专利技术的多核苷酸以顺式方式在用于产生重组蛋白的表达系统中作为表达增强子的用途。所述分离的多核苷酸包含不多于755个核苷酸并且包含来自SEQIDNO:1所示核苷酸序列的至少500个连续的核苷酸。优选地，所述分离的多核苷酸包含来自SEQIDNO:1所示核苷酸序列的至少550、600、650、700或750个连续的核苷酸。所述分离的多核苷酸可以以顺式方式纳入所述表达系统中用于以所述表达系统转染的宿主细胞中增强重组蛋白表达。有利地，甚至可以在没有药物选择的情况下实现所述表达增强。所述表达系统包含用于编码目的蛋白的基因。一些具体的目的蛋白包括例如单克隆抗体（例如曲妥单抗）、红细胞生成素、干扰素、血管内皮生长因子、干细胞生长因子、生长激素、胰岛素样生长因子结合蛋白、调节蛋白（例如cumate操纵子、四环素阻抑蛋白、类固醇激素受体、跨膜受体）等。目的蛋白的氨基酸序列和编码这些蛋白质的基因的核苷酸序列在本领域中通常是已知的。所述表达系统可以包含任何适合的载体，例如质粒载体、附加型载体（例如oriP/EBV载体）、病毒载体（例如Bacman）和粘粒载体。除其他因素外，在所述表达系统中使用的载体的类型取决于意欲使用的宿主细胞，这可由本领域技术人员容易地确定。所述载体包含多种用于操纵所述表达系统的核苷酸序列。这样的核苷酸序列包括例如启动子、复制起点（例如细菌复制起点（pMB1ori）、EB（Epstein–Barr）病毒复制起点（oriP））、前导序列（例如腺病毒三联前导序列（TPL））、剪接供体（SD）、可能包括其他增强子的内含子（例如腺病毒主要晚期启动子增强子（EnhMLP））、剪接受体（SA）、选择标记（例如抗生素抗性基因）、具有限制性内切酶共有位点（优选多个限制性内切酶共有位点，例如EcoRV、Cla1、Sfol）的克隆位点（优选多克隆位点）以及多腺苷酸化信号（例如兔β-珠蛋白多腺苷酸化信号（pA））等。所述表达系统优选地包含质粒载体。启动子可用于控制所述表达系统中多个编码蛋白的多核苷酸的表达。可以使用强或弱启动子。一些启动子包括例如巨细胞病毒（CMV）启动子、猿猴病毒40启动子（SV40p）、延伸因子1α-HTLV（EF1α-HTLV）杂合启动子以及劳斯肉瘤病毒（RSV）启动子。选择标记使得可选择阳性转染的细胞。常见的选择标记包括例如抗生素抗性基因，例如对于真核细胞有嘌呤霉素和潮霉素B，对于原核细胞有氨苄青霉素和卡那霉素。本专利技术的表达系统可通过任何适合的方法转染到宿主细胞中。这样的方法在本领域中通常是已知的（Kim2010）。所述宿主细胞优选地为真核细胞，更优选哺乳动物细胞，例如人胚肾293（HEK293）细胞、中国仓鼠卵巢（CHO）细胞、幼仓鼠肾（BHK21）细胞、PerC6细胞或COS7细胞。尤其优选人胚肾293（HEK293）细胞和中国仓鼠卵巢（CHO）细胞。在适于使得编码所述目的蛋白的多核苷酸表达的条件下培养转染的宿主细胞。对于已知的宿主细胞（例如哺乳动物细胞，例如HEK和CHO细胞），这种条件通常是熟知的。通常在培养基中完成细胞的培养，也可通过已知方法（Hauser1997）便利地实现从培养的细胞回收目的蛋白。有利地，本专利技术的分离的多核苷酸在以顺式的方式纳入表达系统中时，可以增强宿主细胞中的稳定表达，使得在没有药物选择的情况下增强表达稳定性，其可以与附加型表达系统（例如oriP/EBNA1系统）结合用于在没有药物选择的情况下增强表达稳定性（即使用附加型表达系统（例如oriP/EBNA1系统）产生的池在不进行选择的情况下是不稳定的），并且使得可产生用于产生重组蛋白的稳定的池而没有产生稳定克隆的负担。在以下详细描述的过程中，本专利技术的其他特征将被描述或将会变得明显。附图说明为更清楚地理解本专利技术，现在将参考附图通过举例的方式详细描述其实施方案，其中：图1A示出了从现有技术（Strissel1998中图1a）摘录的人干扰素α2基因的限制性内切酶图谱，其显示了多个支架附着区的位置，包括上游支架附着区3（SAR3）。两个EcoRI位点用“E”表示并被圈出。在所述SAR3区中由Strissel鉴定的0.7kbSAR用“j,R=70”表示，也被圈出。图1B示出了从现有技术（Strissel1998中图1c）摘录的限制性内切酶图谱，其显示了本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种分离的多核苷酸，其包含不多于755个核苷酸并且包含来自SEQ?ID?NO:1所示核苷酸序列的至少500个连续的核苷酸。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2011.04.13 US 61/474,8791.一种分离的多核苷酸，其是由如SEQIDNO:1所示的核苷酸序列组成。2.一种用于在宿主细胞中产生重组蛋白的表达系统，其包含，可操作地连接的：编码目的蛋白的基因；用于操纵所述表达系统的核苷酸序列；和，以顺式的方式纳入所述表达系统中用于增强所述基因表达的表达增强子，所述表达增强子包含权利要求1定义的多核苷酸。3.权利要求2的表达系统，其中所述表达系统为质粒载体。4.权利要求2的表达系统，其中所述表达系统为附加型载体。5.权利要求2-4任一项的表达系统，其中所述基因编码单克隆抗体、红细胞生成素、干扰素、血管内皮生长因子、干细胞生长因子、生长激素或胰岛素样生长因子结合蛋白。6.权利要求2-4任一项的表达系统，其中用于操纵所述表达系统的核苷酸序列包含以下中的一种或多种：启动子、复制起点、前导序列、剪接供体、内含子、剪接受体、选择标记、克隆位点、限制性内切酶共有位点和多腺苷酸化信号。7.权利要求5的表达系统，其中用于操纵所述表达系统的核苷酸序列包含以下中的一种或多种：启动子、复...

【专利技术属性】
技术研发人员：Y·杜罗彻尔，
申请(专利权)人：加拿大国家研究委员会，
类型：
国别省市：