用于从微藻提取角鲨烯的方法技术

本发明专利技术涉及用于不使用有机溶剂提取通过使属于破囊壶菌目物种家族的微藻发酵而产生的角鲨烯的方法，其特征在于它包括以下步骤：1)制备属于破囊壶菌目家族的微藻的生物质以降低间质可溶物质的浓度，并且因此获得30%至99%的纯度，表述为相比发酵介质总干重的生物质干重；2)使用选自中性或碱性蛋白酶的组的蛋白酶处理产生的生物质以破坏所述微藻的细胞壁同时阻止由所述酶处理产生的乳液形成；3)离心所产生的反应混合物以将油与水相分离；以及4)回收由此产生的富集角鲨烯的粗制油。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】本专利技术涉及在不存在有机溶剂下，从破囊壶菌属家族的微藻最优化提取角鲨烯的方法。对于本专利技术的目的，表述“破囊壶菌目物种家族的微藻”意在是指属于裂殖壶菌属、Aurantiochytrium sp.和破囊壶菌属物种的微藻。角鲨烯是一种三萜，包括30个碳原子和50个氢原子的类异戊二烯，化学式为:2，6，10，15，19，23-六甲基-2，6，10，14，18，22- 二十四碳六烯。这是一类由所有高等生物，包括在人类(在皮脂中发现)中自然产生的脂类。角鲨烯事实上是在胆固醇、类固醇激素和维生素D生物合成中一种必需中间体(一种胆固醇代谢途径的酶，角鲨烯单加氧酶，通过氧化角鲨烯分子的一个末端将诱导其环化作用并产生羊毛脂留醇，后者将转变为胆固醇或其他类固醇)。在工业上，角鲨烯特别地应用于食品部门、化妆品领域和制药领域。作为食品增补剂，角鲨烯通常被配制为胶囊剂或油类。在化妆品领域，这一分子可以被用作保湿霜中的抗氧化剂、抗静电剂和软化剂，迅速渗透皮肤而不留下脂肪痕迹或感觉，并且与其他油类和维生素混合良好。在这个领域应当注意的是，考虑到角鲨烯极不稳定性(6不饱和的)，它是饱和形式角鲨烷(通过氢化作用获得)，与角鲨烯相比是更好的抗氧化剂，角鲨烷在市场上可以找到，通常来讲有非常高的纯度( 99%)。毒理学研究表明，按照在化妆品中使用的浓度，角鲨烯和角鲨烷并不显示任何毒性并且对人类皮肤无刺激、不致敏。在制药领域中，角鲨烯被用作疫苗的佐剂。这些佐剂是刺激免疫系统并增加对疫苗相应的物质。角鲨烯的纯度水平在应用领域是必要的。事实上，如果口服，角鲨烯被认为是完全安全的，但是注射途径是争论的主题。事实上，在医学领域，在角鲨烯被杂质污染的情况下会增加人类受试者伤害的风险，因为根据定义，这一佐剂也可以因其自身杂质诱导一种强烈的免疫反应。因此必须获得高质量、无杂质的角鲨烯(杂质是指痕量金属，尤其是指汞和其他毒素)。文献中提出了几种生产和提取角鲨烯的途径。它是通常在软骨鱼类的肝脏中发现贮藏的一种化合物，例如深海鲨鱼(角鲨烯因此得名)。因此这就是它们被过度捕捞的原因之一，鲨鱼已经因其鳍而被捕杀。鲨鱼肝脏因此被出售以生产被誉为“有益健康”的胶囊。然而，即使出售的角鲨烯主要从鲨鱼肝脏中提取，也不能排除健康问题。这是因为鲨鱼可以感染病原体，这些病原体可以产生对人类有害的物质。此外，鲨鱼肝脏(生物体的消除和净化器官)可以包含对人类有害的毒素，例如carchatoxin。这些令人担忧的环境问题(鲨鱼数量的大量减少)和令人担忧的健康问题(鱼肝也贮藏令人担忧的有关健康的毒素)，促使人们从植物中提取角鲨烯。因此将它从橄榄油、棕榈油进行提取，以及在来自谷类或源自苋属植物、种子、米糠或小麦胚芽的油中进行分离是可能的。然而，在这种情况中一个主要缺点是提取的角鲨烯量很小，按重量计大约从0.1%至 0.7%。作为从鲨鱼肝脏中或从植物中这些提取方法的第一替代方案，通常由于需要实质上的富集和纯化方法的实施而成本昂贵，人们提出了用于从微生物(天然酵母或重组酵母，特别地是酵母属类型)中生产角鲨烯的第一方法。因此，酿酒酵母因其生产角鲨烯的能力而被熟知，尽管量很小:大约0.041mg/g 生物质(Bhattachar jee, P.et al.(巴特查尔吉，P.等人)，2001，在 World J.Microb.Biotechnol.(《世界微生物学和生物技术期刊》)，17，pp.811-816)中。因此通过遗传重组，已经对其生产能力进行了最优化处理。然而，如用于医学领域(作为疫苗佐剂的纯度高于97%的角鲨烯的生产)的专利申请W02010/023551所呈现的，在具有超高生产角鲨烯重组酵母之前(超过15%的干细胞重量)，这一第一替代方案还不能工业化。然而，这些重组细胞的获得需要使用分子生物学工具，实施大量艰辛的、漫长的和复杂的代谢工程步骤，导致角鲨烯生物合成途径的刺激和角鲨烯分解代谢途径的抑制。作为从鲨鱼肝脏或从植物中提取方法的第二替代方案，提出了用于从破囊壶菌家族(包括破囊壶菌属、Aurantiochytrium和裂殖壶菌属),更特别地Schizochytriummangrovei或裂殖壶菌的微藻生产角S烯的有希望的方法。这些微藻在异养`条件下(无光；提供葡萄糖作为碳源)生产角鲨烯，并且可以因此容易地由微生物发酵领域普通技术人员操作。这些方法因此通过受控制的发酵条件提供纯化很容易达到以满足食品、化妆品和医学的需要的角鲨烯质量。然而在这些破囊壶菌目家族的微藻中，角鲨烯是感兴趣的其他脂类化合物的副产物，例如二十二碳六烯酸(或DHA)，ω 3家族的一种多不饱和脂肪酸。因此特别地角鲨烯被描述为商业DHA油类(连同胡萝卜素和固醇类)的不可皂化部分的组分之一。通过比较，Schizochytrium mangrovei FBI菌株以按细胞干重6.2%的比例生产DHA，对于角鲨烯0.017%。因此，这些自然生产角鲨烯的微生物以小量生产角鲨烯:-对于破囊壶菌ACEM6063 (比较 Lewis et al.(刘易斯等人)，Mar.Biotechnol.(《海洋生物技术》)，2001, pp439-447)，大约0.lmg/g生物质，-对于Schizochytrium mangrovei FBI (比较 Yue Jiang et al.(越江等人)，J.Agric.Food Chem.(《农业食品化学期刊》)，2004, 52，ppll96_1200)，大约 0.162mg/g 生物质。为了增加产量，因此明显的需要最优化发酵条件。然而，尽管做出了所有的努力，这些值依然低于橄榄油的参考值(大约4.24mg/g)。最好地，这些最优化的产量导致的产量大约是:-每g的破囊壶菌ACEM6063生物质，Img至1.2mg的角藍烯(比较Qian Li etal.(钱李等人)，J.Agric.Food Chem(《农业食品化学期刊》).，2009，57，4267-4272 或 Lewiset al.(刘易斯等人)，in Mar.Biotechnol (《海洋生物技术》).，2001，3，439-447);-每g的裂殖壶菌生物质,0.72mg的角藍烯(比较G.Chen etal.(G.陈等人)，NewBiotechnology (《新生物技术》)，2010，27-4, pp382_389)；-每g 的 Aurantiochytrium mangroveiFB31 生物质，0.53mg 的角 S 烯(比较K.ff.Fan et al.(K.W.范等人)，World J.Microbiol.Biotechnol.(《世界微生物与生物技术期刊》)，2010，26-3，ppl303-1309)；-每g的 Schizochytrium mangrovei 生物质，1.17±0.6mg 的角藍烯(比较C-J Yueand Y.Jiang (越和 Y 江)，Process Biochemistry (《生物化学进展》)，2009，44，923-927)。本申请公司自身也致力于通过以下进一步改进破囊壶菌目物种家族的微藻的角鲨烯产量:提供一种使其可能以在本领域的文献中还未达到的水平生产角鲨烯的方法，例如每100g的生物质至少8本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种方法，该方法用于在不存在有机溶剂下提取通过使属于破囊壶菌目物种家族的微藻发酵产生的角鲨烯，其特征在于包括以下步骤：1)制备属于破囊壶菌目家族的微藻的生物质以减少间质可溶物质的浓度，并且因此达到30%和99%之间的纯度，优选地高于95%，表达为相比发酵介质总干重的生物质干重，2)将产生的生物质使用一种蛋白酶进行处理，该蛋白酶选自中性或碱性蛋白酶的组，例如枯草杆菌蛋白酶，以破坏所述微藻的细胞壁同时阻止由所述酶处理产生的乳液形成，3)将产生的反应混合物进行离心以将油与水相分离，并且4)回收由此产生的富集角鲨烯的粗制油。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2011.05.27 FR 11546231.一种方法，该方法用于在不存在有机溶剂下提取通过使属于破囊壶菌目物种家族的微藻发酵产生的角鲨烯，其特征在于包括以下步骤: 1)制备属于破囊壶菌目家族的微藻的生物质以减少间质可溶物质的浓度，并且因此达到30%和99%之间的纯度，优选地高于95%，表达为相比发酵介质总干重的生物质干重， 2)将产生的生物质使用一种蛋白酶进行处理，该蛋白酶选自中性或碱性蛋白酶的组，例如枯草杆菌蛋白酶，以破坏所述微藻的细胞壁同时阻止由所述酶处理产生的乳液形成， 3)将产生的反应混合物进行离心以将油与水相分离，并且 4)回收由此产生的富集角鲨烯的粗制油。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于将在步骤I)中纯化的生物质然后优先地调整至6%和12%之间的干物质含量，优选地至10%和12%之间的干物质含量。3.如权利要求1和权利要求2中任何一项所述的方法，其特征在于在配备有螺旋桨搅拌器和挡板的装置中伴随非...

【专利技术属性】
技术研发人员：塞缪尔·帕蒂尼尔，
申请(专利权)人：罗盖特兄弟公司，
类型：
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