从微藻制备和提取角鲨烯的方法技术

本发明专利技术涉及一种以属于破囊壶菌目物种家族的微藻生产角鲨烯的方法，优选以在每100g干生物质2g与12g之间的浓度生产。该方法其特征在于它包括由以下项组成的步骤：在25℃与35℃之间、优选在28℃与32℃之间、并且更优选在大约30℃的温度下培养属于破囊壶菌目物种家族的微藻；并且向所述培养基以每升培养基添加1μg与1000μg之间的维生素B12。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】本专利技术涉及从破囊壶菌目物种家族的微藻通过发酵而最优化生产角鲨烯的一种方法。出于本专利技术的目的，表述“破囊壶菌目物种家族的微藻”旨在指代属于裂殖壶菌属物种(Schizochytrium sp.)、Aurantiochytrium 物种(Aurantiochytrium sp.)以及破囊壶菌属物种(Thraustochytrium sp.)的微藻。角鲨烯是一种三萜烯，一种包含30个碳原子和50个氢原子的类异戊二烯，具有以下化学式:2，6，10，15，19，23-六甲基-2，6，10，14，18，22- 二十四碳六烯。它是由所有较高级别的有机体，包括人类(在皮脂中发现)天然产生的一种脂质。角鲨烯实际上是胆固醇、类固醇激素和维生素D生物合成中的一种重要的中间产物(胆固醇代谢途径的的一种酶一角鲨烯单加氧酶，通过氧化角鲨烯分子末端之一，将诱导其环化并且产生羊毛留醇，该羊毛留醇被转化成胆固醇和其他类固醇)。在工业上，角鲨烯尤其被用于食品部门、化妆品领域和制药领域。作为一种食品补充剂，角鲨烯通常被配制成胶囊或者油类。在化妆品领域中，这个分子可以用作一种抗氧化剂，在保湿霜中用作抗静电剂和润肤剂，快速渗透进皮肤而不留下脂肪痕迹或者感觉，并与其他油类和维生素类很好地混合。在这个领域，应该注意到，由于角鲨烯非常高的不稳定性(6个不饱和状态)，饱和形式的角鲨烷(通过氢化作用得到)是比角鲨烯更好的抗氧化剂，这种角鲨烷在市场上可以找到，一般具有非常高的纯度(99%)。毒理学研究显示，按照在化妆品中使用的浓度，角鲨烯和角鲨烷都不会展示出任何毒性，并且对人体皮肤没有刺激性或者敏感性。在制药领域，角鲨烯用作疫苗的佐剂。这些佐剂是刺激免疫系统并且增加对疫苗的反应的物质。自从1997年在一种流感疫苗(Fluad,来自Chiron公司，对抗季节性流感)中以每个剂量大约10mg角鲨烯使用角鲨烯以来，角鲨烯已经以添加到接种物质中的乳剂的形式使用以便使得疫苗更易产生免疫性。如所有含有角鲨烯的疫苗，这些乳剂具有乳白色的外观。角鲨烯还被用作一种疫苗佐剂，特别是实验疫苗、抗疟疾物质或者靶向新出现的病毒H5N1及2009H1N1的流感疫苗的佐剂，如:-葛兰素史克公司在对抗2009年流感流行时使用的Pandemrix和Arepanrix疫苗中的AS03佐剂系统的获专利成分，-诺华公司使用的MF59佐剂系统的获专利成分。角鲨烯还被添加在流感疫苗中以通过产生记忆⑶4细胞来刺激人体的免疫应答。流感疫苗的第一个水包油佐剂已经与季节性流感病毒抗原联合上市。角鲨烯的纯度水平在这个应用领域中是至关重要的。实际上，如果口服使用，角鲨烯被认为是完全安全的；但是，注射途径是争议主题。实际上，在医学领域，在角鲨烯被杂质污染的情况下，对人接受者的伤害的风险增加，因为通过确定，这种佐剂还可以诱导对抗其自身杂质的强免疫应答。因此拥有高质量的无杂质(痕量金属，特别是汞，以及痕量的其他毒素类)的角鲨烯至关重要。在文献中建议了一些生产角鲨烯的路径。它是常常发现储存在软骨鱼(例如深海鲨)的肝脏中的一种化合物(因此而得名)。因此这是它们为什么被过度捕渔的原因之一，鲨鱼已经由于其鱼鳍而被猎杀。现在又将鲨鱼的肝脏出售以生产描述为“有益健康”的凝胶胶囊。然而，虽然上市的角鲨烯因此主要从鲨鱼的肝脏中提取，但是并非没有健康问题。这是因为鲨鱼能被一些病原体感染，这些病原体可以产生对人体有害的物质。另外，鲨鱼的肝脏，它是有机体消除和纯化的器官，可能包含对人体有害的例如真鲨毒素的毒素类。这些环境问题(大大降低了鲨鱼的数量)以及健康问题(鱼的肝脏还储存了涉及健康的毒素类)促使了从植物类的提取。因此有可能将它从橄榄油、和棕榈油中分离，以及从来自谷物类的或者源于苋菜、种子、米糠或小麦胚芽的其他油类中分离。但是，这种情况中的主要缺点是角鲨烯被提取出的量非常少，按重量计大约为从0.1% 至 0.7%。通常从鲨鱼肝脏或从植物类提取的这些方法由于进行大量富集和纯化过程而很昂贵，已经提出了作为这些方法的第一个替代方法，该第一个方法是从以下微生物中产生角S烯:天然酵母或重组酵母，特别是酵母菌属(Saccharomyces)类型。由此，酿酒酵母以其产生角鲨烯的能力而为人了解，但是产生的量非常少:大约0.041mg/g生物量(巴塔查尔吉(Bhattachar jee，P.)等人，2001，《世界微生物生物技术杂志》(World J.Microb.Biotechnol.) 17,第 811-816 页)。因此已经通过基因重组的方式进行了优化这些生产能力的工作。产生角鲨烯的重组酵母因此具有以下优势:-受益于与宿主细胞相同的GRAS(通常认为安全)状态，-跟宿主细胞一样没有病原体、没有朊病毒或没有毒素类，以及-已经被用在疫苗领域(例如这些表达了包含乙肝抗原的载体的酵母菌)。然而，如专利申请W02010/023551对于医学领域所呈现的(生产纯度高于97%的角鲨烯作为疫苗佐剂)，只有使得重组酵母菌超生产角鲨烯(高于菌体干重的15%)变得有可能，这第一个替代方法才可以工业化。如果可以发生的话，获得这些重组细胞需要:进行大量的、艰苦的、冗长并复杂的代谢工程化步骤，使用分子生物学工具，导致刺激角鲨烯生物合成路径并且抑制角鲨烯的分解代谢途径。实际上，如所述专利申请W02010/023551另外介绍的，在角鲨烯生物合成中涉及很多基因:包含甲羟戊酸激酶、磷酸甲羟戊酸激酶、焦磷酸甲羟戊酸脱羧酶、异戊二烯焦磷酸异构酶、HMGR (3-羟基-3-甲戊二酰-辅酶A还原酶)以及角鲨烯合成酶 。对于分解代谢途径，基因编码在角鲨烯转化成麦角固醇中涉及的众多酶，包括角鲨烯环氧酶(ERG1)、羊毛留醇合成酶、C14-二甲基化酶、dl4-还原酶、C4-甲基氧化酶、C4-脱羧酶(ERG26)、3-酮还原酶、C24-甲基转移酶、C8-异构酶、C5-去饱和酶、d22_去饱和酶和d24-还原酶。另外，还必须考虑到其他分解代谢酶:LEU2 ( [ β ]_异丙基苹果酸脱氢酶)，环氧角鲨烯环化酶，酵母留醇-24-甲基转移酶以及麦角留-5，7，24 (28)-三烯醇-22-脱氢酶。作为从鲨鱼肝脏或从植物类提取方法的第二个替代方法，已经提出了从破囊壶菌目家族 (包含破囊壶菌属、Aurantiochytrium属和裂殖壶菌属)、更特别地从Schizochytrium mangrovei 或 Schizochytrium Iimacinum 的微藻中生产角藍烯的有希望的方法。这些微藻在异养条件下(无光；提供葡萄糖作为碳源)产生角鲨烯，并且因此可以由微生物发酵领域的普通技术人员容易地操作。因此，这些方法通过可控制的发酵条件提供高质量的角鲨烯，这些角鲨烯的纯化可以很容易地进行以满足食品、化妆品和医学需求。然而在破囊壶菌目家族的这些微藻中，角鲨烯是感兴趣的其他脂质化合物(例如二十二碳六烯酸(或DHA)、ω 3族的多元不饱和脂肪酸)的副产品，。因此似乎角鲨烯被特别描述为商业DHA油类的非皂化部分(连同类胡萝卜素类和甾醇类)的成分之一。相比较而言，Schizochytrium mangrovei FBI菌株产生DHA的比例为菌体干重的6.2%，角鲨烯为0.017%。结论是，天然产生角鲨烯本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种由属于破囊壶菌目物种家族的微藻生产角鲨烯的方法，其特征在于它包含由以下项组成的步骤：?在25℃与35℃之间、优选在28℃与32℃之间、更优选大约30℃的温度下培养属于破囊壶菌目物种家族的微藻，并且?向预培养基或培养基以每升培养基添加1μg至1000μg的维生素B12。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2011.05.20 CN 201110147052.81.一种由属于破囊壶菌目物种家族的微藻生产角鲨烯的方法，其特征在于它包含由以下项组成的步骤: -在25 °C与35 °C之间、优选在28 °C与32 °C之间、更优选大约30 °C的温度下培养属于破囊壶菌目物种家族的微藻，并且 -向预培养基或培养基以每升培养基添加I μ g至1000 μ g的维生素B12。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于加入了以下物质: ο每升培养基0.1mg至200mg的维生素BI,和/或 ο每升培养基0.1mg至200mg的维生素B6。3.如权利要求1和2中任一项所述的方法，其特征在于这种破囊壶菌目家族的的微藻选自下组，该组由以下各项组成:裂殖壶菌属物种(Schizochytrium sp.)、Aurantiochytrium 物种以及破囊壶菌属物种(Thraustochytrium sp.)。4.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其特征在于这种破囊壶菌目家族的微藻选自下组，该组由以下各项组成:裂殖壶菌属物种ATCC20888, Aurantiochytrium物种ATCCPRA276,以及保藏在巴斯德研究所(Institut Pasteur)的法国国家微生物保藏中心、编号为N0.CNCM 1-4469的裂殖壶菌属物种菌株。5.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其特征在于所获得的角鲨烯含量对于100g的干生物质而言为大于 或等于2g，优选地对于100g的干生物质而言为在2g与12g之间。6.如权利要求1至5中任一项所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：伯纳德·波拉，钱云，伯纳德·考利尔，塞吉·科米尼，菲利皮·卢腾，劳伦特·塞盖拉，
申请(专利权)人：罗盖特兄弟公司，
类型：
国别省市：