本发明专利技术涉及了一株经过选育可用于生产甘油酯型DHA的破囊壶菌及其应用。所述破囊壶菌分离自中国深圳沿海水域，已于2012年7月保藏于北京大学深圳研究生院深圳藻类新能源技术开发和应用工程实验室，保藏编号为PKU#SW7。所述破囊壶菌菌体的非极性脂质占总脂质的含量高，为富含甘油酯型DHA的菌株，可应用于工业生产甘油酯型DHA。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及微生物破囊壶菌Aurantiochytrium PKU#SW7，其脂质的主要成分为非极性脂质，其中DHA占总脂质含量高，可以获得高产量的甘油酯型DHA，适用于甘油酯型DHA的工业生产。
技术介绍
多不饱和脂肪酸（polyunsaturated fatty acids，PUFAs）是保持人体健康重要的营养成分之一，特别是DHA和二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acids，EPA)具有非常重要的医药应用和营养价值。 在食品行业中，甘油酯型DHA可添加至牛奶或奶粉中，用作功能性营养物质。 目前，DHA 的商业来源主要是海洋鱼油，沙丁鱼、鳍鱼等含有较高的脂肪组织，在很多国家都被用来生产鱼油，鱼油中DHA 的含量可以达到20-30%。但是以鱼油为原料生产DHA 具有很多缺点，如鱼油产量不稳定，成分复杂，含有鱼腥味，可能存在重金属污染。 在海洋环境中，微生物如海洋微藻、真菌等才是DHA的原始生产者。在这些微生物中，DHA 的相对含量要远高于鱼油中的含量。 破囊壶菌是一类异养的真菌类原生生物，近年来由于其广阔的生物技术应用前景而备受关注。破囊壶菌可以用来生产胞外酶、胞外多糖、类胡萝卜素、ω-3多不饱和脂肪酸如DHA和EPA，以及其他一些工业应用的生物活性物质。 破囊壶菌的脂肪酸组成简单、培养条件成本低，利用破囊壶菌生产DHA，可以有效地解决鱼油DHA存在的问题。因此，作为多不饱和脂肪酸新的生产来源，破囊壶菌是极具潜力进行工业化生产DHA 的微生物。
技术实现思路
r>本专利技术的目的在于提供甘油酯型DHA含量高的破囊壶菌Aurantiochytrium sp. PKU#SW7，可用于工业化生产DHA，添加于牛奶、奶粉或保健品中。 根据本专利技术，提供了一种甘油酯型DHA产量高，保藏于北京大学深圳研究生院深圳藻类新能源技术开发和应用工程实验室，保藏编号为PKU#SW7的破囊壶菌Aurantiochytrium sp.。 该菌株于2012年7月，分离自深圳大鹏湾沿海水域。分离方法的特点在于：采用不同的抗生素组合，利用松花粉垂钓选育。当破囊壶菌富集于松花粉边缘时，挑取松花粉粒，划线培养于琼脂平板上，3-5天后，挑取单菌落划线培养于新的琼脂平板上，以获得纯种破囊壶菌。根据此分离方法，从一个采样点共获得8株破囊壶菌。 在本专利技术中，涉及破囊壶菌脂质的提取和分析。其特点在于：利用氯仿:甲醇=1:2体系的混合物作为抽提溶剂，提取细胞内的总脂质，通过气象色谱对结果进行分析，从而选育出DHA含量高的菌株，即Aurantiochytrium sp. PKU#SW7。 在本专利技术中，还包括破囊壶菌非极性脂质的分离鉴定。利用尼罗红染色，在荧光显微镜下观察显示，破囊壶菌Aurantiochytrium sp. PKU#SW7胞内非极性脂质含量高，定量分析显示，冻干的破囊壶菌Aurantiochytrium sp. PKU#SW7每克包含0.65-0.85g脂质，其中约有75%为非极性脂质，其中甘油酯型DHA约占总DHA的73%。 根据本专利技术，破囊壶菌Aurantiochytrium sp. PKU#SW7细胞内脂肪酸主要为DHA和十六烷酸，两者之和为脂肪酸含量的80-90%，即十六烷酸含量可达35-65%。高含量的十六烷酸说明该菌株也适用于生物柴油的工业生产。 具体实施方式本专利技术发现了存在于中国深圳沿海水域中的破囊壶菌，并从中挑选出了一株富含甘油酯型DHA的菌株。18S rRNA测序结果显示该破囊壶菌为Aurantiochytrium sp.，该菌株被命名为Aurantiochytrium sp. PKU#SW7，保藏于北京大学深圳研究生院深圳藻类新能源技术开发和应用工程实验室。 破囊壶菌Aurantiochytrium sp. PKU#SW7保藏于琼脂平板上。琼脂培养基组成如下：每100ml过滤海水中含葡萄糖1g，蛋白胨0.15g，酵母提取物0.01g，琼脂1g。将划线培养的破囊壶菌Aurantiochytrium sp. PKU#SW7置于室温保藏。 可以根据如下方案制备接种培养液。 从保藏的琼脂平板中挑取生长良好的菌落，接入10-20ml海水培养基中培养，用作接种液。接种液在培养2天后，以大于5%的比例接种于新鲜的海水培养基中。培养条件温度为25-30℃，转速为160rpm，在培养4天后，收集生物质。 培养过程中，利用尼罗红染料对破囊壶菌Aurantiochytrium sp. PKU#SW7细胞进行染色，于荧光显微镜下观察，细胞体内的金黄色荧光显示其非极性脂质含量高。 称取一定量的冻干生物质样品，可以利用氯仿：甲醇=1:2体系的混合物作为抽提溶剂，提取细胞内的总脂质。首先，将称取的干燥生物质放置具塞三角瓶中，添加抽提溶剂后，160rpm振荡1小时后添加氯仿：甲醇=1:1体系溶剂，混合均匀后静置1h，转移出氯仿层，氮吹浓缩即得到总脂质。获得总脂质含量为细胞干重的65-85%，即每克破囊壶菌Aurantiochytrium sp. PKU#SW7冻干细胞含有脂质的量为0.65-0.85g。 对提取的总脂质进行柱色谱分离。采用sigma Discovery DSC-NH2 固相萃取柱，利用正己烷老化柱子，以正己烷：氯仿：甲醇=95:3:2的体系上样。非极性脂质部分首先通过氯仿洗脱得到，极性脂质部分通过两步洗脱得到，第一步采用甲醇：氯仿=6:1洗脱，第二步采用0.05M 醋酸钠溶液（溶剂为甲醇：氯仿=6:1）洗脱。结果显示非极性脂质占总脂质的75%左右。 对柱色谱分离获得的非极性脂质进行薄层色谱分析。采用G型薄层层析硅胶板，进行二维色谱分离。在第一个方向，采用正己烷：乙醚=80:20为展开剂，第二个方向，采用正己烷：乙醚：甲醇=70:20:10为展开剂。结果显示非极性脂质中的主要成分为甘油三酯。 对总脂质、非极性脂质和极性脂质分别进行转酯化反应。采用4%的硫酸甲醇溶液，于80℃酯交换反应1小时，冷却至室温后，用正己烷抽提，用于气象色谱分析。发现DHA占总脂质含量的28-35%，非极性脂质中DHA的含量为20-25%，即甘油酯型DHA达到总DHA含量的73%左右，表明破囊壶菌Aurantiochytrium sp. PKU#SW7是一株非常适用于生产甘油酯型DHA的菌株。 本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种富含甘油酯型DHA的破囊壶菌Aurantiochytrium PKU#SW7，其特征在于：保藏于北京大学深圳研究生院深圳藻类新能源技术开发和应用工程实验室。
2.根据权利要求1，从深圳大鹏湾沿海水域分离出破囊壶菌，并从中挑选出了一株富含甘油酯型DHA的菌株，编号为Aurantiochytrium PKU#SW7。
3.权利要求2中所述的分离方法，其特点在于：采用不同的抗生素组合，利用松花粉垂钓选育，当破囊壶菌富集于松花粉边缘时，挑取松花粉粒，划线培养于琼脂平板上，3-5天后，挑取单菌落划线培养于新的琼脂平板上，以获得纯种破囊壶菌。
4.权利要求1和2中所述的破囊壶菌Aurantiochytriumsp...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘瑛，李晶晶，张善发，成家杨，温志友，袁文桥，
申请(专利权)人：北京大学深圳研究生院，
类型：发明
国别省市：
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