本发明专利技术提供了一种定标测定５’－核苷酸酶的方法及其配用的试剂盒和其用途，本发明专利技术用５’－核苷酸酶脱脱氢酶法检测试剂盒确定５’－核苷酸酶标准品的活性，再应用Ｔｒｉｎｄｅｒ氏法以标准品的活性为参照，定量测定生物样本中５’－核苷酸酶的活性。本发明专利技术优点在于解决了Ｔｒｉｎｄｅｒ氏法的缺陷，提高了精确度，减少了仪器误差以及增强了５’－核苷酸酶正常参考范围数据的可比性且通过测定５’－核苷酸酶的活性用于原发性和转移性肝癌、胆道癌、胰腺癌、胆道阻塞、胆管炎、急、慢性肝炎、肝硬化、药物性肝损伤等疾病的诊断等，适合在医院中进行推广使用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于医学检验测定
，具体涉及一种定标测定5'-核苷酸酶的方法及其配用的试剂盒和其用途。
技术介绍
现有技术中用Trinder氏法定量测定5'-核苷酸酶活性在临床化学检验上较为普遍，但是，Trinder氏法缺点在于没能使用一种公认的标准法测定的5'-核苷酸酶标准品，从而造成测试精确度下降、不同实验室应用不同生化分析仪引起的仪器误差，此外还是5'-核苷酸酶正常参考范围数据混乱、不可比拟性的主要原因。 5'-核苷酸酶脱氢酶法应用5'-核苷酸酶解5'-次黄嘌呤核苷酸生成次黄嘌呤核苷和氨，氨和a -酮戊二酸以及还原性辅酶在谷氨酸脱脱氢酶的作用下反应生成谷氨酸及辅酶，在340nm处检测NADH的消耗速率来测定5'-核苷酸酶活性通过制定氨标准曲线，可定量5'-核苷酸酶活性，5'-核苷酸酶活性定义为在5'-核苷酸酶脱氢酶法条件下37°C每分钟产生一个P mol氨所需5'-核苷酸酶的量，其原理反应方程式如下5'-核苷酸酶5'-次黄嘌呤核苷酸+水--^次黄嘌呤核苷+氨谷氨酸脱氢酶氨+ a —酮戊二酸+还原性辅酶I 二钠盐--^谷氨酸+辅酶 但是5' _核苷酸酶脱氢酶法可定量测定5' _核苷酸酶活性，但此法易受外源性氨的干扰，不适于临床生化检验。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是针对现有技术的现状，而提供一种在Trinder氏法中加入5'-核苷酸酶标准品，用5'-核苷酸酶脱氢酶法确定5'-核苷酸酶标准品的活性，再应用Trinder氏法以5'-核苷酸酶标准品的活性为参照，定量测定生物样本中5'-核苷酸酶活性，从而保证精确度高，测定速度快，且减少了仪器误差以及增强了 5'-核苷酸酶正常参考范围数据的可比性的定标测定5'-核苷酸酶活性的方法。 本专利技术的另一个目的是提供用以实现定标测定5'-核苷酸酶活性的方法的配用的试剂盒。 本专利技术的第三个目的是一种定标测定5'-核苷酸酶活性的方法配用的试剂盒的用途，主要是用于提供5'-核苷酸酶的活性测定用于急性肝损伤及残留病变的诊断以及协助慢性肝病及肝纤维化的诊断。 本专利技术解决上述技术问题所采用的技术方案为一种定标测定5'-核苷酸酶活性的方法，其特征是包括以下步骤 步骤一是确定5' _核苷酸酶标准品的活性； 步骤二是再通过5' _核苷酸酶、嘌呤核苷酸化酶、黄嘌呤氧化酶及过氧化物酶酶 解生成醌化合物； 步骤三是以连续监测醌化合物在546nm处吸光度的上升速率结合标准品的活性 为参照，定量测定生物样本中5'-核苷酸酶的活性。 采取的措施还包括 在上述的一种定标测定5'-核苷酸酶活性的方法中，所述的步骤一中具体操作为 将5'-核苷酸酶样本与试剂RI同时加入，并孵育180秒，然后加入试剂RII，在340nm处连 续120秒定量测定吸光度，并用不同浓度氨代替底物5'-次黄嘌呤核苷酸，按上述方法在 340nm处用测试仪定量测定吸光度，以此画出标准曲线，有5'-核苷酸酶标准品的吸光度从 标准曲线上求出对应的氨浓度，并将其除以反应时间既得出5'-核苷酸酶标准品活性。 在上述的一种定标测定5'-核苷酸酶活性的方法中，所述的试剂RI包括lOmol/ L的5'-次黄嘌呤核苷酸、0. 015mol/L的a_酮戊二酸、0. 30X 10—3mol/L的还原型辅酶I 二 钠盐以及0. 10mol/L的且pH值为7. 20的磷酸缓冲液，所述的试剂RII为200U/ml的谷氨 酸脱脱氢酶。 在上述的一种定标测定5'-核苷酸酶活性的方法中，所述的5'-核苷酸酶样本为 8iiL，试齐U I为150iiL，试剂II为75iiL，5' _核苷酸酶样本与试剂I同时加入，在第180 秒加入试剂II，且温度反应温度控制37°C。 在上述的一种定标测定5'-核苷酸酶活性的方法中，所述的波长的主波长为 560nmnm，副波长为700nm。 在上述的一种定标测定5'-核苷酸酶活性的方法中，所述的步骤三中的计算按以 下公式进行计算 测试时间段每分钟平均吸光度的变化(A A/min)，(△Ayrain + AA2/min +...............AAt/min)△ A/min =-t A A/min代表测试时间第lmin吸光度变化率 A A2/min代表测试时间第2min吸光度变化 ............................................. A At/min代表测试时间第tmin吸光度变化率 t为测试时间 样本5'-核苷酸酶活性=(A Ax/ A Ac) X Ec 其中AAX =样本A A/min AAC =标准品AA/min Ec = 5'-核苷酸酶标准品的活性。 —种定标测定5' _核苷酸酶活性的方法配用的试剂盒，所述的试剂盒由以下成分 组成包括试剂Rl、试剂R2、5'-核苷酸酶标准品、5'-核苷酸酶质控血清以及533测试/ 盒，所述的试剂Rl包括80mol/L的甘氨酸缓冲液、2mol/L的N-乙基_N_ (3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐、0. 5KU/L的嘌呤核苷磷酸化酶、0. 8KU/L的黄嘌呤氧化酶以及0. 6KU/L的过氧化物酶，所述的试剂R2包括1Omol/L的5'-次黄嘌呤核苷酸以及2mol/L的4-氨基安替比林，所述的5'-核苷酸酶标准品为人源基因重组蛋白，5'-核苷酸酶异常血清为人源基因重组蛋白和人血清。 在上述的一种定标测定5'-核苷酸酶活性的方法及其配用的试剂盒中，所述的试剂盒包含试剂R1为80ml/l瓶X2，试剂R2为80ml/l瓶，5'-核苷酸酶标准品lml/1瓶，5' _核苷酸酶异常血清2ml/1瓶。 —种定标测定5'-核苷酸酶活性的方法及其配用的试剂盒的用途中，该测定用于原发性和转移性肝癌、胆道癌、胰腺癌、胆道阻塞、胆管炎、急、慢性肝炎、肝硬化、药物性肝损伤等疾病的诊断。 在上述的一种定标测定5'-核苷酸酶活性的方法及其配用的试剂盒的用途中，所依据的原理反应方程式如下5'-核苷酸酶5' -次黄嘌呤核苷酸+水--^次黄嘌呤核苷+氨嘌呤核苷磷酸化酶次黄嘌呤核苷+磷酸盐--^次黄嘌呤+核糖-1-磷酸黄嘌呤氧化酶次黄嘌呤+水+氧气--^过氧化氢+尿酸过氧化物酶过氧化氢+4-氨基安替比林+N-乙基-N- (3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐--^醌化合物+水。 与现有技术相比，本专利技术的优点在于用5' _核苷酸酶脱氢酶法确定5' _核苷酸酶标准品的活性，再应用Trinder氏法以5'-核苷酸酶标准品的活性为参照，定量测定生物样本中5'-核苷酸酶活性，本专利技术解决了 Trinder氏法的缺陷，提高了测试精确度、减少了仪器误差和增强了 5'-核苷酸酶正常参考范围数据的可比性，也方便了通过测定5'-核苷酸酶的活性用于判断该测定用于原发性和转移性肝癌、胆道癌、胰腺癌、胆道阻塞、胆管炎、急、慢性肝炎、肝硬化、药物性肝损伤等疾病的诊断，适合在医院中进行推广使用。具体实施例方式以下是本专利技术的具体实施例，对本专利技术的技术方案作进一步的描述，但本专利技术并不限于这些实施例。 1、5'-核苷酸酶标准品和其活性的确定 (1) 5'-核苷酸酶标准品活性0-100U/L人源基因重组5'-核苷酸酶 (2) 5' _核苷酸酶标准品活性的确定 试剂组成 试剂RI :包括10mol/L的5'本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种定标测定５’－核苷酸酶活性的方法，其特征是：包括以下步骤： 步骤一是确定５’－核苷酸酶标准品的活性； 步骤二是再通过５’－核苷酸酶、嘌呤核苷酸化酶、黄嘌呤氧化酶及过氧化物酶酶解生成醌化合物； 步骤三是以连续监测醌化合物在５４６ｎｍ处吸光度的上升速率结合标准品的活性为参照，定量测定生物样本中５’－核苷酸酶的活性。
【技术特征摘要】
一种定标测定5’-核苷酸酶活性的方法，其特征是包括以下步骤步骤一是确定5’-核苷酸酶标准品的活性；步骤二是再通过5’-核苷酸酶、嘌呤核苷酸化酶、黄嘌呤氧化酶及过氧化物酶酶解生成醌化合物；步骤三是以连续监测醌化合物在546nm处吸光度的上升速率结合标准品的活性为参照，定量测定生物样本中5’-核苷酸酶的活性。2. 根据权利要求1所述的一种定标测定5'-核苷酸酶活性的方法，其特征是所述的 步骤一中具体操作为将5'-核苷酸酶样本与试剂RI同时加入，并孵育180秒，然后加入试 剂RII，在340nm处连续120秒定量测定吸光度，并用不同浓度氨代替底物5'-次黄嘌呤核 苷酸，按上述方法在340nm处用测试仪定量测定吸光度，以此画出标准曲线，有5'-核苷酸 酶标准品的吸光度从标准曲线上求出对应的氨浓度，并将其除以反应时间既得出5'-核苷 酸酶标准品活性。3. 根据权利要求2所述的一种定标测定5'-核苷酸酶活性的方法，其特征是所述的 试剂RI包括10mol/L的5'-次黄嘌呤核苷酸、0. 015mol/L的a-酮戊二酸、0. 30X 10—3mol/ L的还原型辅酶I 二钠盐以及0. 10mol/L的且pH值为7. 20的磷酸缓冲液，所述的试剂RII 为200U/ml的谷氨酸脱脱氢酶。4. 根据权利要求3所述的一种定标测定5'-核苷酸酶活性的方法，其特征是所述的 5'-核苷酸酶样本为8iiL，试剂I为150iiL，试剂II为75iiL，5'-核苷酸酶样本与试剂I 同时加入，在第180秒加入试剂II，且温度反应温度控制37°C。5. 根据权利要求4所述的定标测定5'-核苷酸酶活性的方法，其特征是所述的波长 的主波长为560nm nm，副波长为700nm。6. 根据权利要求5所述的一种定标测定5'-核苷酸酶活性的方法，其特征是所述的 步骤三中的计算按以下公式进行计算测试时间段每分钟平均吸光度的变化(AA/min)，<formula>for...
【专利技术属性】
技术研发人员：张闻，
申请(专利权)人：张闻，
类型：发明
国别省市：97[中国|宁波]
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