一种鉴别牦牛肉干产品肉种来源的三重ＰＣＲ－ＲＦＬＰ方法技术

快速鉴别牦牛肉、黄牛肉和水牛肉的三重ＰＣＲ－ＲＦＬＰ方法属于分子生物学检测领域，可用于牦牛肉干产品的来源追溯和物种成分的快速鉴别。它解决了目前牦牛肉、黄牛肉和水牛肉鉴别方法准确性低等缺陷，提供了一种牦牛肉、黄牛肉和水牛肉准确鉴别的ＰＣＲ－ＲＦＬＰ方法。可将牦牛肉、黄牛肉和水牛肉按以下方法进行鉴别：提取样品ＤＮＡ，采用通用引物扩增和凝胶电泳检测，然后利用ＨｇａＩ、ＡｐａＩ和ＰｆｌＭＩ限制性内切酶进行同步酶切和ＰＣＲ－ＲＦＬＰ分析，即可快速鉴别牦牛肉、黄牛肉和水牛肉。本发明专利技术采用ＰＣＲ－ＲＦＬＰ方法，具有简便、快捷、廉价和准确性高的特点。

【技术实现步骤摘要】

【技术保护点】
一种快速鉴别牦牛肉、黄牛肉和水牛肉的三重ＰＣＲ－ＲＦＬＰ方法，其特征在于可以把牦牛肉、黄牛肉和水牛肉按以下方法鉴别：（１）１．５ｍＬ离心管中加入约１００ｍｇ样品，用剪刀剪碎，加２００μＬＴＥ溶液（ｐＨ　８．０），旋涡混匀；（２）加入４００μＬ裂解液，旋涡混匀；（３）加入５００μＬ酚∶氯仿∶异戊醇（２５∶２４∶１），剧烈振荡，１２０００ｒｐｍ离心１０ｍｉｎ；（４）取上清液，加入等体积氯仿∶异戊醇（２４∶１），剧烈振荡，１２０００ｒｐｍ离心１０ｍｉｎ；（５）取上清液，加入等体积氯仿，剧烈振荡，１２０００ｒｐｍ离心１０ｍｉｎ；（６）取上清液，加０．８倍体积异丙醇，１２０００ｒｐｍ离心１０ｍｉｎ；（７）弃上清液，收集ＤＮＡ，接着取７０％乙醇清洗１次，再将其室温下自然干燥；（８）加１００μＬＴＥ（ｐＨ　８．０）溶解提取的ＤＮＡ，最后将其－２０℃保存以备用。（９）ＰＣＲ扩增及检测：用可扩增所有脊椎动物Ｃｙｔｂ基因的通用上游引物Ｆ：５’－ＴＡＣ　ＣＡＴ　ＧＡＧ　ＧＡＣ　ＡＡＡ　ＴＡＴ　ＣＡＴ　ＴＣＴ　Ｇ－３’和通用下游引物Ｒ：５’－ＣＣＴ　ＣＣＴ　ＡＧＴ　ＴＴＧ　ＴＴＡ　ＧＧＧ　ＡＴＴ　ＧＡＴ　ＣＧ－３’。ＰＣＲ反应总体积为２５μＬ，其中１０×ＰＣＲＢｕｆｆｅｒ　２．５μＬ，Ｔａｑ　ＤＮＡ聚合酶０．２μＬ（２．５Ｕ／μＬ），ｄＮＴＰｓ（２．５ｍｍｏｌ／Ｌ）２μＬ，１０ｐｍｏｌ／μＬ的上、下游引物各２μＬ，模板ＤＮＡ　２μＬ，灭菌蒸馏水补足总体积。扩增条件为：９５℃变性１０ｍｉｎ，９５℃变性４５ｓ，５３℃退火６０ｓ，７２℃延伸６０ｓ，３５个循环后再７２℃继续延伸７ｍｉｎ。取４μＬＰＣＲ产物与１μＬ　６×ｌｏａｄｄｉｎｇ　ｂｕｆｆｅｒ混合，采用ＴＡＥ缓冲系统，２％琼脂糖凝胶（加入染色剂Ｇｏｌｄ　ｖｉｅｗ　Ｉ）在５ｖ／ｃｍ恒压电泳条件下约２５ｍｉｎ，在凝胶成像系统中观察并记录。（１０）取Ｃｙｔｂ基因片段的ＰＣＲ产物７μＬ，然后依次加入ＨｇａＩ、ＡｐａＩ和ＰｆｌＭＩ三种限制性内切酶各０．５μＬ，ＮＥＢ　ｂｕｆｆｅｒ　２．５μＬ，ｄｄＨ２０９μＬ，３７℃温浴３ｈ。酶切产物用２％的琼脂糖凝胶电泳检测。然后依据酶切图谱进行判断：ＨｇａＩ把牦牛样品酶切割为２２０ｂｐ和２５２ｂｐ，ＡｐａＩ把普通牛样品酶切割为１７３ｂｐ和２９９ｂｐ，ＰｆｌＭＩ把水牛样品酶切割为６９ｂｐ和４０３ｂｐ。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：何建文，安添午，冯海永，张浩，赵会静，罗玉柱，韩建林，王继卿，
申请(专利权)人：中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，甘肃农业大学，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]