一种鉴别羊肉和鸭肉的ＰＣＲ－ＲＦＬＰ方法技术

羊肉和鸭肉鉴别的ＰＣＲ－ＲＦＬＰ方法属于分子生物学检测领域。它设计了一种羊肉制品肉种来源鉴别的方法，解决了目前羊肉和鸭肉鉴别方法准确性低的缺陷，提供了鉴别羊肉和鸭肉的ＰＣＲ－ＲＦＬＰ检测技术。可将羊肉和鸭肉按以下方法加以鉴别：提取样品ＤＮＡ，采用通用引物扩增和凝胶电泳检测，然后分别用Ｂｓｕ３６Ｉ和ＳｐｅＩ限制性内切酶进行ＰＣＲ－ＲＦＬＰ分析，即可区分羊肉和鸭肉。本发明专利技术采用ＰＣＲ－ＲＦＬＰ方法，具有简单、快捷、廉价和准确性高的特点。

【技术实现步骤摘要】

【技术保护点】
一种鉴别羊肉和鸭肉的ＰＣＲ－ＲＦＬＰ方法，其特征在于可将羊肉和鸭肉按以下方法加以鉴别：一、将取５０ｍｇ待检样品放入１．５ｍＬ的ＥＰ管（ＥＰ管应高压灭菌）中，用小剪刀将其剪碎。二、加入ＳＴＥ抽提液６００μＬ、ＰｒｏＫ（２０ｍｇ／ｍＬ）２０μＬ及２０％的ＳＤＳ溶液１５μＬ，在震荡器上充分混匀。三、将ＥＰ管置入水浴锅，５５℃消化过夜（１２－１６ｈ），在此期间可取出颠倒混匀几次，以便消化彻底。四、将ＥＰ管取出，每管加入６００μＬ的Ｔｒｉｓ饱和酚，轻轻摇动混匀１５ｍｉｎ，然后在１２００为３２６ｂｐ和１４６ｂｐ，但不能切割鸭的ＰＣＲ产物，根据琼脂糖凝胶检测结果是否可检测到３２６ｂｐ和１４６ｂｐ的条带来判断是否为羊肉。０ｒｐｍ离心１０ｍｉｎ。五、转移上清液至新的ＥＰ管，加入等体积的酚氯仿异戊醇混合液（酚∶氯仿∶异戊醇体积比为２５∶２４∶１），颠倒混匀１０ｍｉｎ，然后１２０００ｒｐｍ离心１０ｍｉｎ。六、转移上清液至新的ＥＰ管，加入等体积的氯仿异戊醇混合液（氯仿∶异戊醇体积比为２４∶１），轻轻混匀１０ｍｉｎ，然后在１２０００ｒｐｍ离心１０ｍｉｎ。七、转移上清液至新的ＥＰ管，先加入１ｍＬ冰乙醇，再加入６０μＬ的ＮａＡｃ（３Ｍ），轻轻水平摇动，可见絮状、白色ＤＮＡ出现。将ＥＰ管放入－２０℃冰箱冷冻３０ｍｉｎ，然后在１２０００ｒｐｍ离心１０ｍｉｎ，可见ＤＮＡ沉于管底。弃无水乙醇，再用７５％的乙醇洗涤ＤＮＡ两次，然后在１２０００ｒｐｍ离心１０ｍｉｎ；自然干燥后，加入５０μＬ　ＴＥ溶液溶解。八、ＰＣＲ扩增及检测：引物用可扩增所有脊椎动物Ｃｙｔ　ｂ序列的通用上游引物Ｆ：５’－ＴＡＣ　ＣＡＴ　ＧＡＧ　ＧＡＣ　ＡＡＡ　ＴＡＴ　ＣＡＴ　ＴＣＴ　Ｇ－３’和通用下游引物Ｒ：５’－ＣＣＴ　ＣＣＴ　ＡＧＴ　ＴＴＧ　ＴＴＡ　ＧＧＧ　ＡＴＴ　ＧＡＴ　ＣＧ－３’。ＰＣＲ反应总体积为２５μＬ，其中１０×ＰＣＲ　Ｂｕｆｆｅｒ　２．５μＬ，Ｔａｑ　ＤＮＡ聚合酶０．２μＬ（２．５Ｕ／μＬ），ｄＮＴＰｓ（２．５ｍｍｏｌ／Ｌ）２μＬ，１０ｐｍｏｌ／μＬ的上、下游引物各２μＬ，模板ＤＮＡ　２５０ｎｇ，灭菌蒸馏水补足总体积。扩增条件为：９５℃变性１０ｍｉｎ，９５℃变性４５ｓ，５３℃退火６０ｓ，７２℃延伸６０ｓ，３５个循环后在７２℃继续延伸７ｍｉｎ。取４μＬ的ＰＣＲ产物与１μＬ的６×ｌｏａｄｄｉｎｇ　ｂｕｆｆｅｒ混合，采用ＴＡＥ缓冲系统，２％琼脂糖凝胶（加入染色剂Ｇｏｌｄ　ｖｉ...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：冯海永，安添午，何建文，张浩，赵会静，罗玉柱，韩建林，王继卿，
申请(专利权)人：中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，甘肃农业大学，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]