一株HuNoV GII.4临床分离株序列及其感染性克隆的构建与应用制造技术

本发明专利技术公开了一株人诺如病毒(human norovirus，HuNoV)GII.4中国临床分离株序列及其感染性克隆，以及感染性克隆的构建方法与应用，该临床分离株序列和目前公开的国内外HuNoV GII.4序列存在一定的差异，且该克隆能够在多种真核细胞系中有效增殖，并能够产生子代感染性的病毒粒子；灭活后的病毒粒子可以作为HuNoV的一种新型疫苗开发研究。

Construction and Application of Sequence and Infectious Clone of a HuNoV GII.4 Clinical Isolate

【技术实现步骤摘要】
一株HuNoVGII.4临床分离株序列及其感染性克隆的构建与应用
本专利技术涉及基因工程、生物
，具体地说，本专利技术涉及一株人诺如病毒(HuNoV)GII.4中国临床分离株序列及其感染性克隆的构建与应用。该克隆能够在真核细胞中有效增殖并能够产生具有感染性的子代病毒粒子。
技术介绍
人诺如病毒(HumanNorovirus，HuNoV)是引起急性非细菌性流行肠胃炎的主要病原，常爆发在半封闭的社区如疗养院、学校、医院、巡船和救灾机构，并易感于各年龄段的人群，尤其是婴幼儿、老人以及免疫受损的个体[1]，至今仍缺乏NoV疫苗。HUNoV一旦爆发就很难控制，病毒可以通过感染者呕吐物或粪便形成的烟雾状分散的病毒粒子在人和人之间传播，大约18个病毒粒子就可以有效建立感染，并且暴露在外长达2周的病毒仍然具有感染性，且对多种常见消毒剂都有抗性[2]。HuNoV是公共卫生关注的新发病原，被划分为生物防御病原B级，迄今全球已经有26亿7千人感染，且每年有超过20万人因此死亡[3]，据估算每年花费在诺如病毒感染上的费用大概为600亿[4]，给社会公共卫生带来了很大的压力。自1968年首次从流行性肠胃炎检测出Norwalk病毒以来，越来越多的科学家投入了对HuNoV的研究。但由于诺如病毒的遗传多样性以及缺乏自然的体外培养系统及动物感染模型，至今人们对HuNoV感染性腹泻的致病机理仍然缺乏了解[5，6]。病毒的反向遗传学是指采用病毒的遗传材料，在培养细胞或易感宿主中重新拯救出活病毒或类似病毒物质。早期国外已有研究尝试构建HuNoV的反向遗传系统，并取得了一定的成功[7，8]，但是至今还没有中国株HuNoV感染性克隆的报导。我们从中国GII.4阳性腹泻样本中提取了RNA，并逆转录成cDNA，以该cDNA为模板分段扩增HuNoV序列进行测序，获得了该临床分离株的全长序列，该序列与目前国内外发布的HuNoVGII.4序列存在一定的差异；通过overlap的方法将扩增的片段进行拼接获得全长cDNA序列，将该序列连接到5′带有CMV启动子的真核表达载体上，其3′端插入了HDVr/polyA序列以增加全长cDNA的转录效率。CMV启动子是人巨细胞病毒(cytomegalovirus，CMV)极早期启动子，可以在多种真核细胞中调控重组蛋白的高表达。HDVr是丁型肝炎病毒核酶(hepatirisdeltavirusribozyme，HDVr)，可以剪切polyA后面的RNA，有效促进插入片段的转录，而polyA是由多个腺苷一磷酸(adenosinemonophosphates，AMP)组成，对mRNA的核输出、翻译及其稳定性都很重要。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的提供一株HuNoVGII.4中国临床分离株序列，该序列与已公布的国内外HuNoVGII.4序列存在差异，对开展中国HuNoVGII.4相关研究具有重要意义。本专利技术的第二个目的是提供本专利技术所述的HuNoVGII.4中国临床分离株感染性克隆及其构建方法。本专利技术的第三个目的是提供HuNoVGII.4感染性病毒粒子的灭活减毒方法。基于上述目的，一个方面，本专利技术提供了一株人诺如病毒(HuNoV)的感染性克隆，其特征在于其基因组序列为SEQIDNo.1。进一步地，所述的感染性克隆的ORF1序列为SEQIDNo.2、ORF2序列为SEQIDNo.3、ORF3序列为SEQIDNo.4。进一步地，所述的感染性克隆的特征在于将其基因组序列的全长cDNA插入到5′带有CMV启动子的真核表达载体上，其3′端插入了HDVr和polyA序列，其可以在多种真核细胞中有效增殖从而包装出人诺如病毒子代病毒粒子。进一步地，所述感染性克隆包装出来的人诺如病毒子代病毒粒子具有感染性。进一步地，所述感染性克隆的基因组还具有标签序列，优选地，标签序列为GFP或LUC。另一方面，本专利技术所述的HuNoVGII.4中国临床分离株序列来源于GII.4阳性腹泻粪便样品中的基因组序列，序列获得的方法如下：1.采集GII.4阳性腹泻粪便样品，并提取总mRNA；2.通过逆转录PCR(reversetranscription-PCR，RT-PCR)技术，将所得mRNA逆转录为单链cDNA；3.设计HuNoVGII.4各个片段(片段上下游序列部分重叠)特异性扩增的PCR引物对，通过PCR扩增得到各个基因片段；4.将各个基因片段送生物公司测序，获得各片段序列；5.将获得的各片段序列进行拼接，分析获得HuNoVGII.4全长cDNA序列。另一方面，本专利技术所述的HuNoVGII.4中国临床分离株感染性克隆的构建方法，如下：1.将上述扩增的HuNoV的各个片段通过overlap的方法拼接获得全长cDNA片段；2.设计特异性针对HuNoVGII.4全长cDNA两端的PCR引物(通过引物对在该全长cDNA两端分别引入酶切位点AflII和NotI)及上述已合成的各片段的引物对(片段上下游序列部分重叠)，通过PCR扩增得到各个基因片段；3.通过overlapPCR的方法最终获得HuNoVGII.4全长cDNA片段；4.该HuNoVGII.4全长cDNA片段两端分别引入酶切位点AflII和NotI，将HuNoVGII.4全长cDNA片段和载体pcDNA3.1(+)分别进行双酶切，再通过T4DNA连接酶连接酶切载体和片段，获得HuNoVGII.4全长cDNA克隆，并命名为pCMV-HuNoV；5.通过融合的方法，在pCMV-HuNoV的3′端插入HDVr/polyA序列以增加全长cDNA的转录效率。另一方面，本专利技术所述的HuNoVGII.4感染性病毒粒子的灭活减毒方法，如下：1.紫外灭活将10μgHuNoV质粒转染真核细胞C，3天后收集细胞上清；1200rpm，离心5min，取上清；将上清用0.22μM滤器过滤；取病毒上清，紫外室温灭活30min。2.高温灭活收集病毒上清液的方法同上，将病毒上清液60℃高温灭活30min。3.化学灭活收集病毒上清液的方法同上，将病毒上清液用20U/mLbenzonase(全能核酸酶，能降解所有形式(包括单链、双链、线性和环状)的DNA和RNA而没有蛋白裂解活性)，37℃消化24h；用1.5％(v/v)二乙烯亚胺，37℃处理6h；再加入150mM硫代硫酸钠水解未反应的乙烯亚胺，获得失去感染性的HuNoV病毒。本专利技术的感染性克隆有以下几个优点：1.该克隆是目前第一个中国HuNoVGII.4的感染性克隆，且该克隆序列是来源于HuNoVGII.4中国临床分离株，具有重要的临床指导意义；2.该克隆的构建方法简单易行，且该克隆可在多种真核细胞中有效复制，并产生感染性病毒粒子。3.该克隆产生的感染性病毒粒子可以用来开展HuNoV感染相关研究，研究结果将比早期已发表的用HuNoV阳性粪便样品直接感染所取得的结果可信度更高。此外，对于HuNoV不敏感的一些真核细胞的研究，可在转染水平开展相关的研究，在一定程度上解决了HuNoV缺乏细胞培养系统的难题。4.该克隆产生的感染性病毒粒子可以用来开展HuNoV致病机理的相关研究，且可用来研发HuNoV相关疫苗，对控制和治疗HuNoV感染性腹泻具有重要的意义。附图说明图1：HuNoVGII.4感染性本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一株人诺如病毒(HuNoV)的感染性克隆，其特征在于其基因组序列为SEQ ID No.1。

【技术特征摘要】
1.一株人诺如病毒(HuNoV)的感染性克隆，其特征在于其基因组序列为SEQIDNo.1。2.权利要求1所述的感染性克隆，其特征在于ORF1序列为SEQIDNo.2、ORF2序列为SEQIDNo.3、ORF3序列为SEQIDNo.4。3.权利要求1所述的感染性克隆，其特征在于将其基因组序列的全长cDNA插入到5′带有CMV启动子的真核表达载体上，其3′端插入了HDVr和polyA序列。4.权利要求3所述的感染性克隆，其特征在于其可以在多种真核细胞中有效增殖。5.权利要求4所述的感染性克隆，其特征在于可以包装出人诺如病毒子代病毒粒子。6.权利要求1-5中任一项所述的感染性克隆，其特征在于包装出来的人诺如病毒子代病毒粒子具有感染性。7.权利要求6所述的感染性克隆，其特征在于基因组还具有标签序列。8.权利要求7所述的感染性克隆，其特征在于标签序列为GFP或LUC。9.权利要求1-8任一项所述的感染性克隆的构建方法，其特征在于具有以下步骤：1)采集...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡勤学，章牡丹，
申请(专利权)人：中国科学院武汉病毒研究所，
类型：发明
国别省市：湖北,42