【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于基因组编辑克隆的选择和传代的方法、系统和装置领域该领域总体而言涉及用于对细胞群进行基因组编辑的方法、系统和装置。背景基因组修饰技术已被用于研究基因功能几十年。多年来,该领域逐步开发出能够实现越来越大的靶特异性的工具。转座因子提供了稳定改变基因组结构的首批工具之一,但它们的靶位点特异性通常较差,使得它们整合到单个基因组内的许多不同位置。为了实现更高的靶向准确性和更少的靶向事件,开发了“靶向核酸酶”。通过将转录因子的位点特异性DNA结合域与限制酶的核酸内切酶结构域融合,形成早期靶向核酸酶。这种靶向核酸酶的实例包括锌指核酸酶(ZFN)和转录激活因子样效应物核酸酶(TALENS)。通过改变DNA结合域,可以选择性地修饰这种靶向核酸酶的靶特异性。最近开发的第三种技术基于原核成簇规律间隔短回文重复序列(ClusteredRegularlyInterspersedShortPalindromicRepeat,CRISPR)-CRISPR相关(Cas)系统。在细菌和古细菌中发现,CRISPR/Cas作为适应性免疫系统起作用,其中“可编程核酸内切酶”与衍生自CRISPR转录物的小RNA相关联。小RNA将可编程核酸内切酶导向互补DNA序列,通常在感染剂(例如噬菌体)中发现,然后将其切割。为了被切割,靶位点不仅必须与CRISPRRNA互补,而且必须位于靠近由可编程核酸内切酶识别的短序列基序(ProtospacerAdjacentMotif或“PAM”)的位置。2013年,发现由Cas9核酸内切酶和单个RNA分子(称为指导RNA或“gRNA”)组成的简化版本的CRISPR/Ca ...
【技术保护点】
1.一种在包括隔离坞的微流体装置中产生遗传修饰细胞克隆群的方法,所述方法包括:将第一细胞维持在微流体装置的隔离坞中,其中第一细胞已经受基因组编辑过程;将第一细胞扩增成细胞克隆群;并且在克隆群的一个或多个细胞中检测第一核酸序列的存在,其中第一核酸序列指示在细胞克隆群中存在中靶基因组编辑。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.03.16 US 62/309,301;2016.06.17 US 62/351,8461.一种在包括隔离坞的微流体装置中产生遗传修饰细胞克隆群的方法,所述方法包括:将第一细胞维持在微流体装置的隔离坞中,其中第一细胞已经受基因组编辑过程;将第一细胞扩增成细胞克隆群;并且在克隆群的一个或多个细胞中检测第一核酸序列的存在,其中第一核酸序列指示在细胞克隆群中存在中靶基因组编辑。2.如权利要求1所述的方法,其中第一细胞是哺乳动物细胞。3.如权利要求2所述的方法,其中第一细胞是人细胞、啮齿动物细胞、牛细胞、羊细胞、猪细胞、犬细胞或猫细胞。4.如权利要求1所述的方法,其中第一细胞是免疫细胞。5.如权利要求4所述的方法,其中免疫细胞选自T细胞、B细胞、NK细胞、巨噬细胞或其前体。6.如权利要求1所述的方法,其中第一细胞是干细胞。7.如权利要求6所述的方法,其中干细胞是胚胎干细胞、间充质干细胞、脐静脉间充质干细胞或诱导性多能干细胞(iPSC)。8.如权利要求6所述的方法,其中干细胞是造血干细胞、脂肪来源的干细胞、牙龈干细胞、肾干细胞或神经干细胞。9.如权利要求1所述的方法,其中第一细胞是祖细胞。10.如权利要求9所述的方法,其中祖细胞是骨软骨祖细胞、肌成纤维细胞、皮肤成纤维细胞或内皮祖细胞。11.如权利要求1所述的方法,还包括:使第一细胞与基因组编辑生物分子接触;并且将第一细胞引入微流体装置。12.如权利要求11所述的方法,其中基因组编辑生物分子包含供体模板核酸分子。13.如权利要求11所述的方法,还包括:使第一细胞与供体模板核酸分子接触。14.如权利要求13所述的方法,其中第一细胞基本上同时与基因组编辑生物分子和供体模板核酸分子接触。15.如权利要求12所述的方法,其中供体模板核酸分子包含第一核酸序列的全部或部分。16.如权利要求11所述的方法,其中转染第一细胞的步骤在将第一细胞引入微流体装置的步骤之前进行。17.如权利要求11所述的方法,其中转染第一细胞的步骤在将第一细胞引入微流体装置的步骤之后进行。18.如权利要求17所述的方法,其中转染第一细胞根据权利要求46进行。19.如权利要求11所述的方法,还包括基于选自形态学、大小、目标蛋白质的产生、一种或多种细胞表面标志物的存在,和与特定抗体的反应的一个或多个特征选择用于转染的第一细胞。20.如权利要求19所述的方法,还包括将第一细胞放置于隔离坞中,其中所述放置在选择第一细胞之后进行。21.如权利要求1所述的方法,其中微流体装置包括具有DEP配置的衬底,并且其中该方法还包括使用介电电泳(DEP)力将第一T细胞放置于隔离坞中。22.如权利要求1所述的方法,其中检测第一核酸序列包括:从细胞克隆群中选择一个或多个细胞;并且从一个或多个所选的细胞中提取核酸。23.如权利要求22所述的方法,还包括:将一个或多个所选的细胞移出第一个隔离坞;并且从微流体装置输出一个或多个所选的细胞,其中核酸在微流体装置外部提取。24.如权利要求22所述的方法,还包括:将一个或多个所选的细胞从第一隔离坞移动到微流体装置的单独区域,其中核酸在单独区域中提取。25.如权利要求22所述的方法,还包括扩增提取的核酸。26.如权利要求25所述的方法,其中扩增提取的核酸包括进行聚合酶链式反应(PCR)扩增。27.如权利要求25所述的方法,其中扩增提取的核酸包括进行全基因组扩增(WGA)。28.如权利要求25所述的方法,其中扩增提取的核酸包括扩增第一核酸序列。29.如权利要求22所述的方法,其中提取的核酸包含基因组DNA。30.如权利要求22所述的方法,其中提取的核酸包含核糖核酸(RNA)。31.如权利要求30所述的方法,还包括用逆转录酶逆转录提取的RNA。32.如权利要求1所述的方法,其中中靶基因组编辑包括在基因组的靶位点删除内源性脱氧核糖核酸(DNA)。33.如权利要求1所述的方法,其中中靶基因组编辑包括在基因组的靶位点插入外源性脱氧核糖核酸(DNA)。34.如权利要求32所述的方法,其中插入编码功能性生物分子、条形码和/或报道分子。35.如权利要求33所述的方法,其中检测第一核酸序列的存在包括检测插入的全部或部分。36.如权利要求1所述的方法,还包括:在克隆群的一个或多个细胞中检测第二核酸序列的存在,其中第一核酸序列和第二核酸序列的组合指示细胞克隆群中存在中靶基因组编辑。37.如权利要求1所述的方法,还包括:在细胞克隆群的一个或多个细胞中检测额外的核酸序列的存在,其中额外的核酸序列指示细胞克隆群中存在脱靶基因组编辑。38.如权利要求37所述的方法,其中脱靶基因组编辑包括在靶位点之外的基因组的位点的内源性DNA的删除和/或外源性DNA的插入。39.如权利要求1所述的方法,其中微流体装置包括具有含介电电泳(DEP)配置的衬底的第一部分和具有含电润湿(EW)配置的衬底的第二部分,并且其中隔离坞位于微流体装置的第一部分。40.如权利要求1所述的方法,其中微流体装置包括具有介电电泳(DEP)配置的第一衬底和具有电润湿(EW)配置的第二衬底,第一和第二衬底通过桥接区域连接,并且其中隔离坞位于包含第一衬底的微流体装置的部分。41.如权利要求1所述的方法,其中将第一细胞扩增成细胞克隆群还包括监测克隆群的细胞的一个或多个特征一段时间。42.如权利要求41所述的方法,其中在一段时间内周期性地进行监测。43.如权利要求41所述的方法,其中监测包括识别克隆群中细胞的大小和/或形态学的变化。44.如权利要求41所述的方法,其中监测包括确定第一细胞增殖到细胞克隆群的速率。45.如权利要求41所述的方法,其中监测包括评估目标蛋白质的产生、一种或多种细胞表面标志物的存在和/或与特定抗体的反应。46.一种在微流体装置内进行靶向基因组编辑的方法,该方法包括:选择用于基因组编辑的第一细胞;将第一细胞放置于微流体装置的编...
【专利技术属性】
技术研发人员:G·G·拉维厄,A·莫西亚罗,关晓,J·M·麦克尤恩,M·苏米隆,J·坦纳·内维尔,V·L·S·库尔兹,P·A·迪克,R·K·拉梅纳尼,
申请(专利权)人:伯克利之光生命科技公司,
类型:发明
国别省市:美国,US
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。