测定生物细胞的方法技术

本文公开了用于对生物细胞进行测定的方法，包括一般功能测定。本文还公开了对来自生物细胞的RNA的5'端进行条形码化的方法和从条形码化RNA制备表达构建体的方法。条形码化RNA可以编码目标蛋白，例如B细胞受体(BCR)重链和轻链序列。可以单独或以配对/多重方式生成表达构建体，从而允许快速重新表达个体蛋白或蛋白复合物。白复合物。白复合物。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】测定生物细胞的方法
[0001]本申请是非临时申请，根据35U.S.C.119(e)要求2020年9月21日提交的美国临时申请号63/080,960；于2020年9月7日提交的美国临时申请号63/075,269；以及于2021年6月16日提交的美国临时申请号63/211,337的权益，其中每项公开内容均通过引用以其整体并入本文。
[0002]本申请与电子格式的序列表一起提交。序列表以2021年8月27日创建的名称为“01149
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0018
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00PCT_ST25.txt”的文件形式提供，大小为17,595字节。序列表电子格式的信息通过引用以其整体并入本文。
[0003]专利技术介绍和概述
[0004]本申请涉及测定生物细胞的方法。本申请还涉及对来自生物细胞的RNA的5'端进行条形码化的方法以及从条形码化RNA制备表达构建体的方法。
[0005]在过去的三十年里，针对许多不同疾病开发了抗体疗法，从自身免疫性病症到感染性疾病和癌症。基于细胞的测定法能够针对天然抗原进行筛选，因此可以加速治疗性抗体先导候选物的选择。然而，使用典型工作流程筛选先导候选物细胞所需的时间显著增加了药物开发时间表。例如，在对动物进行免疫并从脾脏、骨髓或淋巴结中收集产生抗体的B淋巴细胞(或B细胞)后，可能需要至少12周的时间才能产生杂交瘤并筛选所有潜在的命中，从而延长了开发过程。
[0006]片上筛选系统的最新发展允许更快地选择先导候选物。例如，可以在微流体装置的腔室中平行克隆数万个细胞，并且可以进行多次测定以全面表征有希望的先导候选物。可以在芯片上进行自动细胞裂解和逆转录，以生成稳定的cDNA分子，随后可以将其回收用于配对的重链/轻链扩增和测序。然而，由于抗体产生细胞(尤其是浆细胞)的寿命较短，因此可以回收的序列总数受到该时间范围内的输出能力的限制。此外，验证获得的抗体序列需要克隆输出的cDNA、在培养物中重新表达抗体以及芯片外测定。使用传统的克隆和重新表达方法完成这项工作可能会很慢并且需要大量劳动。因此，需要允许快速选择和/或重新表达抗体的抗体发现工作流程。
[0007]本文公开了用于从生物细胞提供一个或多个条形码化cDNA序列的方法。此外，本文还公开了从捕获的条形码化cDNA序列制备用于蛋白表达的表达构建体的方法。
[0008]在一些实施方案中，提供了测定第一分子和第二分子之间特异性结合相互作用的抑制的方法。在一些实施方案中，该方法在具有腔室的微流体装置内进行，该方法包括：将微物体引入微流体装置的腔室中，其中微物体包含多个第一分子；将细胞引入腔室中，其中细胞能够产生目标分子；在微物体的存在下，并且在有利于目标分子的产生和分泌的条件下，在腔室中孵育细胞；在腔室中孵育细胞后，将第二分子引入腔室中，其中第二分子与可检测标记结合；以及监测第二分子在微物体上的积累，其中第二分子在微物体上的积累不存在或减少表明目标分子抑制第一分子与第二分子的结合。
[0009]在一些实施方案中，将微物体引入腔室中还可以包括基于检测微物体的活力情况来选择单个微物体。检测活力情况还可以包括采用机器学习算法为微物体分配活力概率。
[0010]在一些实施方案中，提供了一种从生物细胞提供一个或多个条形码化cDNA序列的
方法。在一些实施方案中，该方法包括在腔室内提供生物细胞；在腔室中提供捕获物体，捕获物体包含标记、多个第一寡核苷酸和多个第二寡核苷酸，其中多个第一寡核苷酸中的每个第一寡核苷酸均包含条形码序列和在3'端包含至少三个连续鸟嘌呤核苷酸的序列，其中多个第二寡核苷酸中的每个第二寡核苷酸均包含捕获序列；裂解生物细胞并允许从裂解的生物细胞释放的RNA被多个第二寡核苷酸的捕获序列捕获，从而形成捕获的RNA；以及反转录捕获的RNA，从而产生一个或多个条形码化cDNA序列，每个条形码化cDNA序列均包含与相应的一个捕获的RNA互补的寡核苷酸序列，该捕获的RNA共价连接至第一寡核苷酸的条形码序列的反向互补序列。
[0011]在一些实施方案中，将生物细胞引入腔室中还可以包括基于检测生物细胞的活力情况来选择生物细胞。检测活力情况还可以包括采用机器学习算法为生物细胞分配活力概率。
[0012]在一些实施方案中，提供捕获物体，该捕获物体包含标记、多个第一和第二寡核苷酸，其中多个第一寡核苷酸中的每个第一寡核苷酸均包含条形码序列，以及在3'端包含至少三个连续鸟嘌呤核苷酸的序列，并且其中多个第二寡核苷酸中的每个第二寡核苷酸均包含捕获序列。在一些实施方案中，提供了一种试剂盒，其包括本文描述的多个捕获物体。在一些实施方案中，提供了一种试剂盒，包括具有多个腔室的微流体装置和多个捕获物体，根据本文所述的任何捕获物体，每个捕获物体均具有多个第一和第二寡核苷酸。
[0013]在一些实施方案中，提供了一种用于将微物体引入微流体装置的腔室中的方法，该方法包括：将一个或多个微物体引入微流体装置的流动区域中；确定一个或多个微物体的活力情况；从一个或多个微物体中选择具有活力的至少一个微物体；以及将该至少一个微物体引入微流体装置的腔室。在一些实施方案中，在不标记一个或多个微物体的情况下执行确定活力情况，例如，微物体是无标记的。在一些实施方案中，确定活力情况还可以包括采用机器学习算法为一个或多个微物体中的每一个分配活力概率。在一些实施方案中，机器学习算法可以包括经训练的机器学习算法，其中训练可以包括对具有区分活力情况的标记的微物体进行成像。具有该标记的微物体形成分子训练集，并且可以是与引入到微流体装置的流动通道的一个或多个微物体相同种类的微物体。
[0014]所公开方法的这些和其他特征和优点将在随后的描述和所附权利要求中阐明或变得更加明显。这些特征和优点可以通过所附实施例、部分实施方案列表和权利要求中特别指出的目的和组合来实现和获得。此外，所描述的方法的特征和优点可以通过实践获知或者将从如下文所阐述的描述中显而易见。
[0015]应当理解，前面的一般描述和下面的详细描述都只是示例性和解释性的，而不是对权利要求的限制。包含在本说明书中并构成本说明书一部分的附图举例说明一个(多个)实施方案，并且与描述一起用于解释本文描述的原理。
[0016]附图简要说明
[0017]图1A示出了根据本公开的一些实施方案的微流体装置和具有相关联的控制设备的系统。
[0018]图1B示出了根据本公开的实施方案的具有隔离坞的微流体装置。
[0019]图2A
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2B示出了根据本公开的一些实施方案的具有隔离坞的微流体装置。
[0020]图2C示出了根据本公开的一些实施方案的微流体装置的隔离坞。
[0021]图3示出了根据本公开的一些实施方案的微流体装置的隔离坞。
[0022]图4A至4B示出了根据本公开的一些实施方案的微流体装置的动电特征。
[0023]图5A示出了根据本公开的一些实施方案的用于与微流体装置和相关联的控制设备一起使用的系统。
[0024]图5B示出了根据本公开的一些本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种测定第一分子和第二分子之间特异性结合相互作用的抑制的方法，其中所述方法在具有腔室的微流体装置内进行，所述方法包括：将微物体引入微流体装置的腔室中，其中所述微物体包含多个第一分子；将细胞引入腔室中，其中所述细胞能够产生目标分子；在微物体的存在下，以及在有利于目标分子的产生和分泌的条件下，在腔室中孵育细胞；在腔室中孵育细胞后，将第二分子引入腔室中，其中所述第二分子与可检测标记结合；以及监测第二分子在微物体上的积累，其中第二分子在微物体上的积累不存在或减少表明所述目标分子抑制第一分子与第二分子的结合。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述目标分子与微物体上的第一分子结合，从而抑制第二分子与微物体的结合。3.根据权利要求1所述的方法，其中所述目标分子与第二分子结合，从而抑制第二分子与微物体上的第一分子的结合。4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述第一分子是受体分子，并且其中所述第二分子是与所述受体分子特异性结合的配体。5.根据权利要求4所述的方法，其中所述受体分子是蛋白。6.根据权利要求5所述的方法，其中所述受体是生长因子受体、细胞因子受体、趋化因子受体、粘附受体、离子通道、G蛋白偶联受体(GPCR)或任何前述受体的保留其各自全长生物分子活性的片段。7.根据权利要求4所述的方法，其中所述配体是蛋白。8.根据权利要求4所述的方法，其中所述配体是生长因子、细胞因子、趋化因子、粘附配体、离子通道配体、GPCR配体、病毒蛋白(例如，病毒融合蛋白)或任何前述配体的保留其各自全长生物分子活性的片段。9.根据权利要求1所述的方法，其中包含多个第一分子的微物体是细胞。10.根据权利要求1所述的方法，其中所述目标分子是抗体。11.根据权利要求10所述的方法，其中能够产生目标分子的细胞是抗体产生细胞(APC)。12.根据权利要求1所述的方法，其中将所述微物体选择性地引入腔室中。13.根据权利要求1所述的方法，其中将微物体引入腔室中包括基于检测所述微物体的活力情况来选择性地引入所述微物体。14.根据权利要求13所述的方法，其中检测活力情况件还包括使用机器学习算法为所述微物体分配活力概率。15.根据权利要求1所述的方法，其中所述腔室是微孔或隔离坞。16.根据权利要求1所述的方法，其中所述腔室包括约200pL至约10nL的体积。17.根据权利要求1所述的方法，其中所述微流体装置包括多个腔室，并且其中所述方法还包括：将微物体引入所述多个腔室的每个腔室中，其中所述微物体包含多个第一分子；
将细胞引入所述多个腔室中的每个腔室中，其中所述细胞能够产生目标分子；在微物体的存在下，以及在有利于目标分子的产生和分泌的条件下，在所述多个腔室中孵育细胞；在所述多个腔室中孵育细胞后，将第二分子引入所述多个腔室的每个腔室中，其中所述第二分子与可检测标记结合；以及监测所述第二分子在微物体上的积累。18.根据权利要求1所述的方法，其中监测所述第二分子在每个微物体上的积累包括将所述积累与在目标阳性对照分子和/或目标阴性对照分子的存在下观察到的积累进行比较。19.一种从生物细胞提供一个或多个条形码化cDNA序列的方法，包括：在腔室内提供生物细胞；在腔室中提供捕获物体，所述捕获物体包含标记、多个第一寡核苷酸和多个第二寡核苷酸，其中多个第一寡核苷酸中的每个第一寡核苷酸均包含条形码序列和在每个第一寡核苷酸的3'端均包含至少三个连续鸟嘌呤核苷酸的序列，其中多个第二寡核苷酸中的每个第二寡核苷酸均包含捕获序列，裂解所述生物细胞并允许从裂解的生物细胞释放的RNA被所述多个第二寡核苷酸的捕获序列捕获，从而形成捕获的RNA；以及反转录捕获的RNA，从而产生一个或多个条形码化cDNA序列，每个条形码化cDNA序列均包含与捕获的RNA的相应一个互补并共价连接至第一寡核苷酸的条形码序列的反向互补序列的寡核苷酸序列。20.根据权利要求19所述的方法，其中所述腔室包括微流体装置的微孔或隔离坞。21.根据权利要求19所述的方法，其中在所述腔室中提供单个捕获物体。22.根据权利要求19所述的方法，其中所述捕获序列结合RNA并由此捕获RNA并引发捕获的RNA的转录。23.根据权利要求19至22中任一项所述的方法，还包括在捕获物体位于腔室内时识别所述多个第一寡核苷酸的条形码序列。24.根据权利要求19所述的方法，其中所述第一寡核苷酸包含所述条形码序列5'的一个或多个尿苷核苷酸。25.根据权利要求19所述的方法，其中逆转录捕获的RNA是在切割含有一个或多个尿苷核苷酸的序列的酶的存在下进行的。26.根据权利要求19所述的方法，其中所述捕获物体上的第二寡核苷酸与第一寡核苷酸的比率范围为1:10至10:1。27.根据权利要求19所述的方法，其中所述第一寡核苷酸连接至所述捕获物体。28.根据权利要求19所述的方法，其中所述第二寡核苷酸连接至所述捕获物体。29.根据权利要求19所述的方法，其中所述一个或多个条形码化cDNA序列中的每一个均与所述捕获物体结合。30.根据权利要求19所述的方法，还包括从所述腔室中导出捕获物体。31.根据权利要求19所述的方法，其中提供一个或多个条形码化cDNA序列包括提供多
个条形码化cDNA序列，所述多个条形码化cDNA序列中的每一个均编码目标蛋白，所述目标蛋白对应于多种不同蛋白中的任何一种，所述条形...

【专利技术属性】
技术研发人员：M，
申请(专利权)人：伯克利之光生命科技公司，
类型：发明
国别省市：