一种检测人结肠癌的核酸适体及其在制备检测制剂中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种可靶向检测结肠癌细胞的核酸适体及其应用，该核酸适体的核苷酸序列为5’‑ACGCTCGGATGCCACTACAGGTTGGGGTCGGGCATGCGTCCGGAGAAGGGCAAACGAGAGGTCACCAGCACGTCCATGAG‑3’。本发明专利技术的核酸适体的稳定性好，能特异性识别靶标分子，在体内的免疫原性小，易于被排除。该适体分子量小，制备成本低，可通过体外化学合成得到，易于贮存和运输。采用本发明专利技术的核酸适体可以对多种结肠癌细胞进行检测，且操作简单、迅速，有助于结肠癌的早期诊断、靶向治疗及预后等。

【技术实现步骤摘要】
一种检测人结肠癌的核酸适体及其在制备检测制剂中的应用
本专利技术涉及一种核酸适体及其应用，特别是涉及一种可用于人结肠癌细胞及临床样本组织检测的核酸适体及其制备检测试剂的应用方法。
技术介绍
结直肠癌是一种恶性程度很高的消化系统肿瘤，其全球死亡率位于第三位。结直肠癌的发生与体外环境和体内因素有很大的关联。体外环境中的饮食习惯（如长期高热量、高脂肪饮食）和生活方式（如缺乏运动）都是导致结直肠癌发生的诱因。体内因素主要是与家庭遗传史有关，如家族性腺瘤性息肉病家系（FAP）、遗传性非息肉性结直肠癌家系（HNPCC）。随着经济飞速发展，人们的生活水平日渐提高，饮食习惯和生活方式随之发生改变，结直肠癌的发病率和死亡率也在逐年提升，每年约新增病例120万，且有60%发生于发达国家，发展中国家占新增病例的40%。在我国，结直肠癌的发病率和死亡率将比于上世纪90年代都有明显的提升。结直肠癌已成为威胁我国人民健康的重要肿瘤之一。手术切除是目前结直肠癌治疗的首选方式，但是结直肠癌的肝转移会导致手术切除失败。约15%-20%的结直肠癌在进行第一次手术时已经发生肝转移，术后结直肠癌复发产生肝转移的概率约达50%。化疗是应对术后复发及产生转移性结直肠癌患者的主要治疗方法，但化疗缺乏靶向性，会对正常组织和细胞产生毒副作用。目前用于结直肠癌靶向治疗的药物主要包括伊立替康、卡培他滨、奥沙利铂、西妥昔单抗、帕尼单抗等，但某些基因突变的结直肠癌患者的靶向药物治疗效果不显著。结直肠癌的疾病分期是最重要的预后因素。在美国，Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期的结直肠癌患者5年生存率分别为90.1%、69.2%、69.2%、11.7%。Ⅰ期和Ⅳ期的结直肠癌患者术后生存率分别为90%和10%。因此，结直肠癌的早期筛查和治疗是治疗结直肠癌患者的重要方法之一。美国在2018年公布的癌症统计数据表明，美国结直肠癌死亡率在25年内下降了52%，主要得益于美国在这20年间进行的筛查。筛查在临床上主要是指在早期通过各类化学、影像等医学手段对将要发生或已经发生的疾病进行早期检查，进而在早期就对疾病进行治疗和控制，减少晚期病例，降低死亡率。但我国的肠镜筛查非常欠缺。一方面是由于大部分国民对于肠镜检查的意义并不重视和了解。另一方面，内镜检查是一种侵入性的检查方式，有一定的不适和并发症，让人产生畏惧心理，导致一些结直肠的疾病无法得到早期发现和确诊，错过了最佳治疗时期。综上，研发一种能靶向识别结直肠癌且能对结直肠癌进行早期识别的分子药物对于结直肠癌的筛查和治疗都具有重大的意义。
技术实现思路
本专利技术人利用实验室中的SwanLibrary（plosone,2014,9(1):e87002-e87002）中的所有适体对人结肠癌细胞进行流式结合验证，最终得到可以与多种人结肠癌细胞（HCT116、HT29、LoVo、Caco2、SW620、HCA7、DLD1）结合且不与人正常肠上皮细胞（FHs74Int、NCM460）结合的适体。因而，本专利技术的目的提供一种高度特异性、稳定性、可用于人结肠癌检测的适体及其在制备检测试剂中的应用方法。本专利技术提供一种检测人结肠癌的核酸适体，其核苷酸序列如下所示：5’-AGGTTGGGGTCGGGCATGCGTCCGGAGAAGGGCAAACGAGAGG-3’，或者在其两端分别增加1至20个碱基，或进行标记修饰。优选地，其核苷酸序列如下所示：5’-ACGCTCGGATGCCACTACAGGTTGGGGTCGGGCATGCGTCCGGAGAAGGGCAAACGAGAGGTCACCAGCACGTCCATGAG-3’、5’-CCACTACAGGTTGGGGTCGGGCATGCGTCCGGAGAAGGGCAAACGAGAGGTCACCAGCACGTCCATGAG-3’、5’-CTCGGATGCCACTACAGGTTGGGGTCGGGCATGCGTCCGGAGAAGGGCAAACGAGAGGTCACCAGCAC-3’、或者5’-CGGATGCCACTACAGGTTGGGGTCGGGCATGCGTCCGGAGAAGGGCAAACGAGAGGTCACCAGCACGT-3’。更优选地，其核苷酸序列如下所示：5’-ACGCTCGGATGCCACTACAGGTTGGGGTCGGGCATGCGTCCGGAGAAGGGCAAACGAGAGGTCACCAGCACGTCCATGAG-3’。进一步地，所述标记修饰是指在核酸适体连接上荧光物质、放射性物质、治疗性物质、生物素、或者酶标记，更进一步地，所述标记修饰是指Cy5标记。本专利技术还提供上述的检测人结肠癌的核酸适体在制备检测人结肠癌的制剂中的用途。进一步地，本专利技术还提供检测人结肠癌的制剂中的试剂盒，其含有如上述的检测人结肠癌的核酸适体。本专利技术具有以下有益效果：目前结肠癌细胞缺乏能早期识别的分子探针，本专利技术筛选得到的核酸适体能靶向识别结直肠癌，特别是结直肠癌早期组织。该适体具有免疫源性低、稳定性好、分子量小、易于修饰和标记的特点，且可以在体外通过化学合成得到，制备成本低，易于保存。本专利技术的适体可特异性识别人结肠癌细胞，为结肠癌的准确诊断、快速定位、靶向治疗和预后提供了有力的手段。附图说明图1为swanlibrary中的ssDNA与人结肠癌细胞（HCT116）的结合情况；图2为DML7与人结肠癌细胞（HCT116、HT29、LoVo、Caco2、SW620、HCA7、DLD1）、人正常肠上皮细胞（FHs74Int、NCM460）的结合情况；图3DML7序列经过一系列的删减后与人结肠癌细胞（HCT116）的结合情况；图4为DML7与人结肠癌细胞（HCT116、HT29、LoVo等）的亲和性；图5核酸适体DML7与线粒体荧光探针在HT29、LoVo活细胞共定位情况；图6核酸适体DML7对临床结肠癌组织切片的靶向识别能力。具体实施方式以下实施例中的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。以下实施例中所用的实验材料如无特殊说明，均为购自常规生化试剂商店。细胞来源：本实验所用到的细胞系人结肠癌细胞（HCT116、HT29、LoVo、Caco2、SW620、HCA7、DLD1），人正常肠上皮细胞（FHs74Int、NCM460）均购自于中科院上海细胞库。实施例1：确定与结肠癌细胞系结合能力最高的序列首先，将Swanlibrary中的所有序列用DPBS稀释到终浓度为250nM，并在95℃变性5min，在冰上复性10min，然后放置于常温。其次，将贴壁的结肠癌细胞用0.2%的EDTA从培养皿上消化下来并收集到离心管中，用洗涤缓冲液（WashingBuffer：DPBS，0.45%的葡萄糖，5mM氯化镁）洗涤离心多次。然后往细胞中分别加入准备好的适体序列和结合缓冲液（BindingBuffer：DPBS，0.45%的葡萄糖，5mM氯化镁，100mg/LtRNA，1g/LBSA）。将整个混合体系置于4℃摇床孵育1h，然后用洗涤缓冲液（WashingBuffer：DPBS，0.45%的葡萄糖，5mM氯化镁）洗涤离心2次，最后用流式细胞仪检测荧光（结果见图1）。检测结果如图1所示，DML7与结肠癌细胞HCT116细胞的结合能力最强。实施例2：DML7特异性识别结肠癌细胞本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测人结肠癌的核酸适体，其特征在于，其核苷酸序列如下所示：5’‑AGGTTGGGGTCGGGCATGCGTCCGGAGAAGGGCAAACGAGAGG‑3’，或者在其两端分别增加1至20个碱基，或进行标记修饰。

【技术特征摘要】
1.一种检测人结肠癌的核酸适体，其特征在于，其核苷酸序列如下所示：5’-AGGTTGGGGTCGGGCATGCGTCCGGAGAAGGGCAAACGAGAGG-3’，或者在其两端分别增加1至20个碱基，或进行标记修饰。2.根据权利要求1所述的检测人结肠癌的核酸适体，其特征在于，其核苷酸序列如下所示：5’-ACGCTCGGATGCCACTACAGGTTGGGGTCGGGCATGCGTCCGGAGAAGGGCAAACGAGAGGTCACCAGCACGTCCATGAG-3’5’-CCACTACAGGTTGGGGTCGGGCATGCGTCCGGAGAAGGGCAAACGAGAGGTCACCAGCACGTCCATGAG-3’、5’-CTCGGATGCCACTACAGGTTGGGGTCGGGCATGCGTCCGGAGAAGGGCAAACGAGAGGTCACCAGCAC-3’、或者5’-CGGATGCCACTACA...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡小晓，谭蔚泓，彭程，廖涛，文超琪，
申请(专利权)人：湖南大学，
类型：发明
国别省市：湖南,43