胰高血糖素类似物及其使用方法技术

本发明专利技术的主题涉及化学和热力学稳定的胰高血糖素类似物，其对脱酰胺作用和原纤维形成具有抗性。本发明专利技术进一步公开了用于胰高血糖素类似物的重组表达和纯化的改进方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】胰高血糖素类似物及其使用方法交叉引用本申请要求于2016年6月9日提交的第62/348,101号美国临时专利申请的权益，该临时申请的公开内容通过引用以其全文并入本文。序列表本申请包含序列表，该序列表已经以ASCII格式电子提交，并且通过引用以其全文并入本文。所述ASCII副本创建于2017年5月26日，被命名为39538-711_601_SL.txt，并且大小为11,052个字节。
技术介绍
先天性高胰岛素血症(CH)是一种儿童和新生儿中的罕见病况，其特征在于持续性低血糖症，在美国活产婴儿中的发病率约为1/30,000。患有CH的新生儿中有超过60％在第一个月内发生低血糖症，而其余的将在第一年内或之后不久得以诊断。在不同类型的CH中，对二氮嗪无响应的严重持续性CH需要使用胰高血糖素和/或葡萄糖联合胰高血糖素来治疗。此外，在美国每年有超过20,000例低血糖急诊并且有超过2,000人死亡，其中许多是由于未能迅速治疗I型糖尿病患者的低血糖症所致，并且可以通过施用胰高血糖素来预防。
技术实现思路
本公开内容涉及用于治疗低血糖症的组合物及其使用方法。本文描述了在生理pH下的溶液中稳定的胰高血糖素类似物的组合物。在一些实施方案中，组合物包含胰高血糖素类似物，其中所述胰高血糖素类似物由天然存在的氨基酸组成；并且所述胰高血糖素类似物在pH为pH6至pH8的溶液中稳定。在多个方面，所述胰高血糖素类似物在pH为约7.4的溶液中稳定。在一些方面，在溶液中稳定包括对原纤维形成具有抗性、对化学降解具有抗性或其组合。在其他方面，对原纤维形成具有抗性包括与天然胰高血糖素相比具有降低的计算聚集评分的聚集并且在溶液中至少7天的时间段后具有降低的实验聚集。在进一步的方面，所述胰高血糖素类似物在与天然胰高血糖素中的易聚集区域相对应的区域中包含突变。在更进一步的方面，天然胰高血糖素的氨基酸残基Phe6、Tyr10或Tyr13或其组合被另一氨基酸残基替代。在多个方面，对化学降解具有抗性包括是热力学稳定的、化学稳定的或其组合。在一些方面，当至少80％的所述胰高血糖素类似物在溶液中至少7天后未降解或未聚集时，所述胰高血糖素类似物是热力学稳定的。在其他方面，如果所述胰高血糖素类似物的脱酰胺作用在至少7天的时间段后相对于天然胰高血糖素减少，则所述胰高血糖素类似物对化学降解具有抗性。在一些方面，所述胰高血糖素类似物在氨基酸残基22与氨基酸残基27之间的区域中包含至少一个突变。在进一步的方面，在氨基酸残基22与氨基酸残基27之间的区域中包含至少一个突变的所述胰高血糖素类似物的计算聚集评分低于天然胰高血糖素。在更进一步的方面，在氨基酸残基22与氨基酸残基27之间的区域中包含至少一个突变的所述胰高血糖素类似物产生α-螺旋稳定化。在一些方面，所述胰高血糖素类似物与SEQIDNO:1-SEQIDNO:19中的任一个或其片段具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％的序列同一性。在其他方面，所述胰高血糖素类似物包含SEQIDNO:1-SEQIDNO:19中的任一个。在进一步的方面，所述胰高血糖素类似物是人胰高血糖素类似物。在多个方面，所述胰高血糖素类似物的纯度为至少90％、95％、97％或99％。在其他方面，所述胰高血糖素类似物的C-末端包含天然胰高血糖素C-末端的稳定化α-螺旋结构。在一些方面，所述胰高血糖素类似物包含相对于天然胰高血糖素的Phe22、Val23、Trp25、Leu26、Met27、Asp15或其组合。在一些方面，所述胰高血糖素类似物在相对于天然胰高血糖素的Phe22、Val23、Trp25、Leu26、Met27、Asp15或其组合处包含突变。在其他方面，所述胰高血糖素类似物具有天然胰高血糖素的胰高血糖素受体激动剂活性的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。在一些方面，当在4℃下储存时，所述胰高血糖素类似物保持至少95％的效力达至少2年。在进一步的方面，当在40℃下储存时，所述胰高血糖素类似物保持至少95％的效力达至少3个月。在多个实施方案中，药物组合物包含任何前述方面的组合物和药学上可接受的稀释剂。在进一步的方面，所述药物组合物被配制用于皮下、静脉内、腹膜内、肌肉内、动脉内或经皮施用。在一些实施方案中，多核苷酸包含编码根据任一前述组合物的胰高血糖素类似物的核酸序列。在其他实施方案中，载体包含编码表达标记物的第一核苷酸序列；编码裂解标记物的第二核苷酸序列；以及编码根据任一前述组合物的胰高血糖素类似物的第三核苷酸序列，其中所述第一、第二和第三核苷酸序列以可操作的组合排列；其中所述表达标记物包含与SEQIDNO:21(MKAIFVLKGSLDRDPEFPSDKPHHKKHHKKHHSSGSLE)具有至少80％序列同一性的氨基酸序列；并且其中所述裂解标记物包含Trp(W)氨基酸。在一些方面，所述表达标记物进一步包括亲和标记物。在其他方面，所述亲和标记物包含至少六个具有带电荷侧链的氨基酸。在一些实施方案中，所述载体进一步包含编码包涵体指引肽的核苷酸序列。在多个方面，所述包涵体指引肽选自：类固醇异构酶(ketosteroidisomerase)、类固醇异构酶的包涵体指引功能片段、类固醇异构酶的包涵体指引功能同系物、BRCA2肽、BRCA2的包涵体指引功能片段，和BRCA2的包涵体指引功能同系物。在其他实施方案中，所述载体进一步包含在细菌细胞或酵母细胞中有活性的核苷酸启动子序列。在多个实施方案中，用于产生胰高血糖素类似物的方法包括在遗传修饰的细胞中表达异源融合肽，所述异源融合肽包含表达标记物、裂解标记物和任一前述组合物的胰高血糖素类似物，其中所述表达标记物包含与SEQIDNO:21(MKAIFVLKGSLDRDPEFPSDKPHHKKHHKKHHSSGSLE)或其片段具有至少80％序列同一性的氨基酸序列，并且其中所述裂解标记物包含Trp(W)氨基酸；以及裂解所述异源融合肽以从所述异源融合肽释放所述胰高血糖素类似物，从而产生所述胰高血糖素类似物。在一些方面，所述胰高血糖素类似物的纯度为至少95％。在其他方面，所述胰高血糖素类似物的纯度为至少99％。在多个方面，所述表达标记物进一步包括亲和标记物。在进一步的方面，所述亲和标记物包含至少六个具有带电荷侧链的氨基酸。在其他实施方案中，所述方法进一步包括通过所述亲和标记物将所述异源融合肽与亲和材料结合。在一些方面，在将所述异源融合肽与所述亲和材料结合之后，所述方法进一步包括洗涤所述亲和材料以去除未结合的材料。在多个实施方案中，当所述异源融合肽通过所述亲和标记物与所述亲和材料结合时，所述方法的第二部分中的裂解所述异源融合肽发生。在其他方面，在将所述异源融合肽与所述亲和材料结合之后，所述方法进一步包括使所述异源融合肽经受足以折叠目标肽的条件。在其他方面，所述异源融合肽进一步包含包涵体指引肽。在一些方面，所述包涵体指引肽选自：类固醇异构酶、类固醇异构酶的包涵体指引功能片段、类固醇异构酶的包涵体指引功能同系物、BRCA2肽、BRCA2的包涵体指引功能片段和BRCA2的包涵体指引功能同系物。在其他方面，在裂解所述异源融合肽之前，所述方法进一步包括从所述遗传修饰的细胞取出含本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种包含胰高血糖素类似物的组合物，其中：所述胰高血糖素类似物由天然存在的氨基酸组成；并且所述胰高血糖素类似物在pH为pH 6至pH 8的溶液中稳定。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.06.09 US 62/348,1011.一种包含胰高血糖素类似物的组合物，其中：所述胰高血糖素类似物由天然存在的氨基酸组成；并且所述胰高血糖素类似物在pH为pH6至pH8的溶液中稳定。2.如权利要求1所述的组合物，其中所述胰高血糖素类似物在pH约为7.4的溶液中稳定。3.如权利要求1-2中任一项所述的组合物，其中在溶液中稳定包括对原纤维形成具有抗性、对化学降解具有抗性或其组合。4.如权利要求2-3中任一项所述的组合物，其中对原纤维形成具有抗性包括与天然胰高血糖素相比具有降低的计算聚集评分并且在溶液中至少7天的时间段后具有降低的实验聚集。5.如权利要求1-4中任一项所述的组合物，其中所述胰高血糖素类似物在与天然胰高血糖素中的易聚集区域相对应的区域中包含突变。6.如权利要求1-5中任一项所述的组合物，其中天然胰高血糖素的氨基酸残基Phe6、Tyr10或Tyr13或其组合被另一氨基酸残基替代。7.如权利要求2-6中任一项所述的组合物，其中对化学降解具有抗性包括是热力学稳定的、化学稳定的或其组合。8.如权利要求7所述的组合物，其中当至少80％的所述胰高血糖素类似物在溶液中至少7天后未降解或未聚集时，所述胰高血糖素类似物是热力学稳定的。9.如权利要求2-8中任一项所述的组合物，其中如果所述胰高血糖素类似物的脱酰胺作用在至少7天的时间段后相对于天然胰高血糖素减少，则所述胰高血糖素类似物对化学降解具有抗性。10.如权利要求1-9中任一项所述的组合物，其中所述胰高血糖素类似物在氨基酸残基22与氨基酸残基27之间的区域中包含至少一个突变。11.如权利要求10所述的组合物，其中在氨基酸残基22与氨基酸残基27之间的区域中包含至少一个突变的所述胰高血糖素类似物的计算聚集评分低于天然胰高血糖素的计算聚集评分。12.如权利要求10或11中任一项所述的组合物，其中在氨基酸残基22与氨基酸残基27之间的区域中包含至少一个突变的所述胰高血糖素类似物产生α-螺旋稳定化。13.如权利要求1-12中任一项所述的组合物，其中所述胰高血糖素类似物与SEQIDNO:1-SEQIDNO:19中的任一个或其片段具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％的序列同一性。14.如权利要求1-13中任一项所述的组合物，其中所述胰高血糖素类似物包含SEQIDNO:1-SEQIDNO:19中的任一个。15.如权利要求1-14中任一项所述的组合物，其中所述胰高血糖素类似物是人胰高血糖素类似物。16.如权利要求1-15中任一项所述的组合物，其中所述胰高血糖素类似物的纯度为至少90％、95％、97％或99％。17.如权利要求1-16中任一项所述的组合物，其中所述胰高血糖素类似物的C-末端包含天然胰高血糖素C-末端的稳定化α-螺旋结构。18.如权利要求1-17中任一项所述的组合物，其中所述胰高血糖素类似物包含相对于天然胰高血糖素的Phe22、Val23、Trp25、Leu26、Met27、Asp15或其组合。19.如权利要求1-17中任一项所述的组合物，其中所述胰高血糖素类似物在相对于天然胰高血糖素的Phe22、Val23、Trp25、Leu26、Met27、Asp15或其组合处包含突变。20.如权利要求1-19中任一项所述的组合物，其中所述胰高血糖素类似物具有天然胰高血糖素的胰高血糖素受体激动剂活性的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。21.如权利要求1-20中任一项所述的组合物，其中当在4℃下储存时，所述胰高血糖素类似物保持至少95％的效力达至少2年。22.如权利要求1-21中任一项所述的组合物，其中当在40℃下储存时，所述胰高血糖素类似物保持至少95％的效力达至少3个月。23.一种药物组合物，其包含如权利要求1-22中任一项所述的组合物和药学上可接受的稀释剂。24.如权利要求23所述的药物组合物，其中所述药物组合物被配制用于皮下、静脉内、腹膜内、肌肉内、动脉内或经皮施用。25.一种多核苷酸，其包含编码根据权利要求1-22中任一项所述的胰高血糖素类似物的核酸序列。26.一种载体，其包含：(a)编码表达标记物的第一核苷酸序列；(b)编码裂解标记物的第二核苷酸序列；以及(c)编码根据权利要求1-22中任一项所述的胰高血糖素类似物的第三核苷酸序列；其中所述第一、第二和第三核苷酸序列以可操作的组合排列，其中所述表达标记物包含与SEQIDNO:21(MKAIFVLKGSLDRDPEFP...

【专利技术属性】
技术研发人员：迈克尔·H·B·斯托威尔，米哈伊尔·普拉姆，彭彦宇，
申请(专利权)人：阿米德生物有限责任公司，
类型：发明
国别省市：美国,US