一种circRNA标记物及其应用制造技术

本发明专利技术属于生物检测领域，具体涉及生物的分子检测，更具体涉及一种circRNA标记物及其应用。本发明专利技术成功检测出circRNA标记物在心脏手术后有无房颤发作中具有比较明显的表达差异，通过检测本发明专利技术所提供的circRNA标记物的特异性引物对可以快速、早期检测出术后房颤的发生风险，提供辅助诊断治疗手段，将circRNA标记物应用于制备术后房颤发生率辅助评估或早期评估产品中，有利于进一步阐明术后房颤发生发展机理、信号通路等，极具应用前景和理论价值。

A circRNA Marker and Its Application

The invention belongs to the field of biological detection, in particular to molecular detection of organisms, and more specifically relates to a circRNA marker and its application. The invention successfully detects whether the circRNA marker has obvious expression difference in atrial fibrillation after cardiac surgery. By detecting the specific primers of the circRNA marker provided by the invention, the risk of atrial fibrillation after operation can be quickly and early detected, and the auxiliary diagnostic and therapeutic means can be provided. The circRNA marker is applied to the preparation of auxiliary assessment of the incidence of atrial fibrillation after operation. Early evaluation products are helpful to further elucidate the mechanism and signaling pathway of AF after operation, and have great application prospects and theoretical value.

【技术实现步骤摘要】
一种circRNA标记物及其应用
本专利技术属于生物检测领域，具体涉及生物的分子检测，更具体涉及一种circRNA标记物及其应用。
技术介绍
心脏手术后心房颤动（房颤）的发生率很高，大约有30%的冠状动脉旁路移植手术（CABG）患者并发房颤或心房扑动，而瓣膜手术后并发房颤或房扑的比例则高达60%。研究表明术后房颤患者有其各自特点，如加以重视，进行有效治疗，其效价比明显高于非手术后房颤，但以往研究对心脏手术后房颤关注较少。近年来，随着分子生物学基因芯片技术的发展，越来越多的研究者利用分子生物学基因芯片技术探索了各类生物小分子与疾病的关系，环状RNA(circRNA)是目前研究重大疾病分子机理的热点。circRNA是一类保守性好、特异性高，对靶基因能发挥调控作用的内源性非编码RNA。都过基因手段筛选具有差异表达的circRNA作为疾病相关的生物标志物，并对其进行功能研究，可以更好地了解疾病发生的分子机制，进而提高相关疾病的预防和诊断水平，但现有技术中对环状RNA与房颤发病之间的联系的研究还处于空白阶段。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种在心脏手术后房颤发作患者血液中高表达的circRNA标记物，并提供扩增上述circRNA标记物的特异性引物对，以及利用所述引物对进行术后房颤发作早期筛查、预后靶点辅助评估产品开发或收集术后房颤发作预测评估信息中的应用。为了解决上述问题，本专利技术提供的技术方案是：一种在心脏手术后房颤发作患者血液中高表达的circRNA标记物hsa_circ_0067621（http://www.circbase.org/），其核苷酸序列如SEQIDNO：1所示。本专利技术还提供了扩增上述在心脏手术后房颤发作患者血液中高表达的circRNA标记物的特异性引物对，其上游引物核苷酸序列如SEQIDNO.2所述，即：5’-TGTTTCGCATTATTAAACCCAGGA-3’；其下游引物核苷酸序列如SEQIDNO.3所述，即：5’-TCAAATTCAGGAATCTAAAACGCCT-3’。所述引物对是采用PCR技术，经过大量筛选性试验，根据circRNA标记物的核苷酸序列，所设计的特异性引物对心脏手术后房颤发作患者血液样本进行PCR扩增，可获得111bp大小的特异性片段，扩增产物通过目的条带确定待检测样本中circRNA的表达量。本专利技术还提供了心脏手术后房颤发作患者血液中高表达的circRNA标记物的特异性引物对在获取术后房颤发生的早期预测信息或制备术后房颤发生辅助评估产品中的应用。所述产品通过测定样本中的circRNA标记物的表达水平与参考水平相比上调而确定。可通过测序技术、核酸杂交技术、核酸扩增技术的方法检测环状RNA标记物基因的表达水平。另一方面，本专利技术提供一种非诊断和治疗目的的试剂盒，所述试剂盒含有能够定量检测circRNA标记物的试剂；所述试剂盒含有上述扩增标志物的特异性引物对。进一步地，所述的试剂盒还包含TaqDNA聚合酶、逆转录酶、PCR缓冲液、dNTPs、MgCl2和DEP水。本专利技术所述试剂盒，用于获取心脏手术后房颤发作的早期预测信息或制备术后房颤发生辅助评估产品。与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：目前用于心脏手术后房颤发作的临床辅助诊断技术尚不完善，本专利技术成功检测出circRNA标记物在心脏手术后有无房颤发作中具有比较明显的表达差异，通过检测本专利技术所提供的circRNA标记物的特异性引物对可以快速、早期检测出术后房颤的发生风险，提供辅助诊断治疗手段，将circRNA标记物应用于制备术后房颤发生率辅助评估或早期评估产品中，有利于进一步阐明术后房颤发生发展机理、信号通路等，极具应用前景和理论价值。附图说明图1为术后房颤患者血液与术后无房颤患者血液中hsa_circ_0067621的相对表达量情况图。图2为hsa_circ_0067621的实时荧光定量核酸扩增检测系统（QPCR）电泳图；M为DNA分子量标准，编号1-3代表，编号4代表。具体实施方式下面结合附图，进一步阐释本专利技术，这些实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术范围；实施例中未注明具体条件的实验方法，均按照常规条件；所述试剂和生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。实施例一：1．样本收集收集30例术后房颤和术后无房颤患者的血液，患者均知情同意，上述所有标本的取得均通过医院伦理委员会的同意。2．RNA样本的制备（1）临床血清样本收集后12000rpm高速离心10min，重复2次，所得血清样本-80℃保存；（2）冻存血清样本4℃解冻；（3）吸取250µL的血清样本至1.5m1EP管，加750µLTrizolLSReagent，吹打混匀，静置5min；（4）加氯仿(CHCl3：Trizol250µL:750µL)，颠倒混匀，静置15min；（5）4℃，12000rpm，离心15min；（6）小心吸取上层液体至一新EP管；（7）加适量异丙醇(异丙醇：trizo1500µL：750µL)，颠倒混匀，静置10min；（8）4℃，12000rpm离心10min；（9）弃上层离心液，加75％乙醇(RNA酶灭活)；（10）4℃，8000rpm离心5min；（11）保留沉淀，弃上层离心液，室温静置5-10min；（12）适量DEPC水溶解沉淀，取适量RNA溶液测浓度及观察RNA抽提情况；（13）标记名称、浓度及日期，-80℃保存。3、逆转录（1）反应体系：RNA模板1µL，随机引物1µL，双蒸水加至12µL，混匀，低转速离心，65℃5min，然后放在冰上冷却。继续在12µL反应液中加入下列成分：5×反应缓冲液4µL，RNA酶抑制剂(20U/µL)1µL，10mMdNTP混合液2µL，AMV反转录酶(200U/µL)1µL；充分混匀并进行离心处理；（2）逆转录反应条件：25℃5min，42℃60min，70℃5min，4℃保温60min。（3）聚合酶链反应根据Genebank中hsa_circ_0067621基因的序列设计QPCR引物序列。具体引物序列如下：上游引物核苷酸序列如SEQIDNO.2所述，即：5’-TGTTTCGCATTATTAAACCCAGGA-3’；下游引物核苷酸序列如SEQIDNO.3所述，即：5’-TCAAATTCAGGAATCTAAAACGCCT-3’。4．PCR扩增配置PCR反应体系：2×qPCR混合液12.5µL、基因引物2.0µL、反转录产物2.5µL、ddH2O8.0µL。PCR反应条件如下：95℃预变性10min，(95℃15s，60℃30s,72℃30s)×40个循环，72℃延伸5min。实施例二：根据实施例一的PCR扩增结果，以SYBRGreen作为荧光标记物，在LightCycler荧光定量PCR仪上进行PCR反应，通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，ΔΔCT法进行相对定量。实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS18.0统计软件来进行统计分析的，为术后无房颤发作患者与术后房颤发作患者的配对比较采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。如图1所示，hsa_circ_0067621在术后房颤发作患者的表达量明显多于术后无房颤发作患者的表达量，hsa本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种circRNA标记物，其特征在于，所述标记物的扩增引物序列如下：SEQIDNO.2：5’‑TGTTTCGCATTATTAAACCCAGGA‑3’；SEQIDNO.3：5’‑ TCAAATTCAGGAATCTAAAACGCCT ‑3’。

【技术特征摘要】
1.一种circRNA标记物，其特征在于，所述标记物的扩增引物序列如下：SEQIDNO.2：5’-TGTTTCGCATTATTAAACCCAGGA-3’；SEQIDNO.3：5’-TCAAATTCAGGAATCTAAAACGCCT-3’。2.一种检测血液中circRNA表达量的方法，所述方法为非诊断和治疗目的的方法，其特征在于，采用权利要求1所述的标记物的扩增引物序列对待测材料进行PCR扩增，扩增产物通过目的条带确定待检测样本中circRNA的表达量。3.如权利要求1所述的标记物在获取术后房...

【专利技术属性】
技术研发人员：申红星，肖卉，刘庭君，
申请(专利权)人：江苏大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32