用于检测PIK3CD基因E1021K位点突变的探针和引物组合及试剂盒制造技术

本发明专利技术提出一种用于检测人类PIK3CD基因C.3061G>A,P.E1021K位点突变的突变型及野生型探针和引物组合。正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；所述探针包括突变型探针，所述突变型探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。本发明专利技术通过设计科学合理的特异性的PIK3CD基因C.3061G>A,P.E1021K检测引物和探针，以更好的实现基于荧光定量PCR的方法检测，基于本发明专利技术提供的探针和引物的基础上所实现的荧光定量PCR的方法在保证高灵敏度和高特异性的基础上，实验周期更短、成本更低。

【技术实现步骤摘要】
用于检测PIK3CD基因E1021K位点突变的探针和引物组合及试剂盒
本专利技术属于生物医药
，尤其涉及一种用于检测人类PIK3CD基因c.3061G>A,p.E1021K位点突变的探针和引物组合及试剂盒。
技术介绍
PI3K-δ过度活化综合征是由PIK3CD基因突变引起的一种常染色体显性遗传免疫缺陷病。该病通常表现为T细胞及B细胞分化和功能的缺陷。主要临床症状有：儿童期起病的反复呼吸道感染、淋巴结肿大、结节性淋巴样增生、脾大、进行性淋巴细胞减少、抗体应答缺陷以及CMV和/或EBV感染导致的病毒血症。虽然淋巴结病变和结节性淋巴样增生是非癌性的(良性的)，但PI3K-δ过度活化综合征也增加了形成癌症B细胞淋巴瘤的风险。该病起病早，病情重，严重者可致命。而该病可以通过雷帕霉素治疗，效果较好。因此早期诊断将有利于患儿的尽早治疗，挽救患者生命。目前针对PI3K-δ过度活化综合征可以通过对PIK3CD全基因Sanger测序或高通量测序技术(NextgenerationSequencing)对PIK3CD基因及其它基因进行深度测序，可以获得PIK3CD整个基因内的突变信息，但不可避免的存在测序成本高、实验周期长等缺点。前期研究发现c.3061G>A,p.E1021K为该病的突变热点，中华儿科杂志所报道的中国最大宗PI3K-δ过度活化综合征患者均为该点突变。因此如何实现快速的检测这个位点可以迅速的对该病进行初筛，缩短诊断周期、降低检测成本，成为本领域技术人员亟待解决的技术难题。
技术实现思路
本专利技术针对上述的技术问题，提出一种用于检测人类PIK3CD基因c.3061G>A,p.E1021K位点突变的探针和引物组合及试剂盒，以使PIK3CD基因c.3061G>A,p.E1021K位点突变的检测灵敏度更高、特异性更高且可重复性好，同时能够降低试验成本，实现PIK3CD基因c.3061G>A,p.E1021K位点突变的快速检测，并且能够区分野生型、杂合突变型及纯合突变型。如果该病存在体细胞突变或嵌合体，也可检测其突变频率。一种用于检测人类PIK3CD基因c.3061G>A,p.E1021K位点突变的探针和引物组合，所述引物包括正向引物和反向引物，所述正向引物的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示，所述反向引物的核苷酸序列如SEQIDNO:2所示；所述探针包括突变型探针，所述突变型探针的核苷酸序列如SEQIDNO:3所示。作为优选，所述正向引物、反向引物和所述突变型探针的摩尔比为1:1:1。作为优选，所述探针还包括野生型探针，所述野生型探针的核苷酸序列如SEQIDNO:4所示。作为优选，所述突变型探针和野生型探针的5’端标记有荧光基团，3’端标记有淬灭基团。作为优选，所述荧光基团为FAM、CY5、HEX、VIC、ROX中的任一种。其中所述荧光基团和淬灭基团可基于实际的使用需要或成本考虑进行筛选。具体的所述突变型探针的荧光基团为FAM，淬灭基团为BHQ1；所述野生型探针荧光基团为CY5，淬灭基团为BHQ2。或者所述所述突变型探针的荧光基团为CY5，淬灭基团为BHQ2；所述野生型探针荧光基团为FAM，淬灭基团为BHQ1。上述所选择的两组荧光基团和淬灭基团，在实现PIK3CD基因c.3061G>A,p.E1021K位点突变定量检测的基础上，具有较低的使用成本。作为优选，所述正向引物与反向引物的摩尔比为1:1，所述野生型探针与突变型探针的摩尔比为1:1，所述正向引物与所述野生型探针的摩尔比为(1-3)：1。更为优选的，所述正向引物、反向引物、野生型探针和突变型探针的摩尔比为1:1:1:1。一种用于检测人类PIK3CD基因c.3061G>A,p.E1021K位点突变的试剂盒，包括上述的用于检测人类PIK3CD基因c.3061G>A,p.E1021K位点突变的探针和引物组合。一种上述用于检测人类PIK3CD基因c.3061G>A,p.E1021K位点突变的探针和引物组合在制备用于检测人类PIK3CD基因c.3061G>A,p.E1021K位点突变及突变率的试剂盒中的应用。一种上述用于检测人类PIK3CD基因c.3061G>A,p.E1021K位点突变的探针和引物组合在制备用于筛查PIK3CD基因c.3061G>A,p.E1021K位点突变相关PI3Kδ过度活化综合征的产品中的应用。与现有技术相比，本专利技术的优点和积极效果在于：本专利技术提供的用于检测人类PIK3CD基因c.3061G>A,p.E1021K位点突变探针和引物组合及试剂盒，通过设计科学合理的特异性的PIK3CD基因c.3061G>A,p.E1021K位点突变检测引物、突变型探针和野生型探针，以更好的实现基于荧光定量PCR的方法以检测人类PIK3CD基因c.3061G>A,p.E1021K位点突变，相对于Sanger测序和高通量测序的检测方法，基于本专利技术提供的探针和引物的基础上所实现的荧光定量PCR的方法在保证高灵敏度和高特异性的基础上，实验周期更短、成本更低的效果。而特异性的荧光探针相对于普通的PCR，又降低了假阳性，即非特异性扩增的出现。针对提取的基因组DNA，本专利技术可以进行最低50ngDNA、突变率最低10％的检测，并且最终的荧光曲线Ct值≤33，说明本专利技术所提供的引物和探针具有较高的灵敏度。附图说明后文将参照附图以示例性而非限制性的方式详细描述本专利技术的一些具体实施例。附图中相同的附图标记标示了相同或类似的部件或部分。本领域技术人员应该理解，这些附图未必是按比例绘制的。附图中：图1为本专利技术实施例1检测c.3061G>A,p.E1021K位点突变的野生型、E1021K杂合突变型、E1021K纯合突变型FAM通道示意图；图2为本专利技术实施例1检测c.3061G>A,p.E1021K位点突变的野生型、E1021K杂合突变型、E1021K纯合突变型CY5通道示意图；图3为本专利技术实施例3检测c.3061G>A,p.E1021K位点不同突变频率FAM通道示意图；图4为本专利技术实施例3检测c.3061G>A,p.E1021K位点不同突变频率CY5通道示意图。具体实施方式下面将对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚完整地描述，显然所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。本专利技术实施例提供了一种用于检测人类PIK3CD基因c.3061G>A,p.E1021K位点突变的探针和引物组合，所述引物包括正向引物和反向引物，所述正向引物的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示，所述反向引物的核苷酸序列如SEQIDNO:2所示；所述探针包括突变型探针，所述突变型探针的核苷酸序列如SEQIDNO:3所示。在一可选实施例中，所述正向引物、反向引物和所述突变型探针的摩尔比为1:1:1。在一可选本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于检测人类PIK3CD基因c.3061G>A,p.E1021K位点突变的探针和引物组合，其特征在于：所述引物包括正向引物和反向引物，所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；所述探针包括突变型探针，所述突变型探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。

【技术特征摘要】
1.一种用于检测人类PIK3CD基因c.3061G>A,p.E1021K位点突变的探针和引物组合，其特征在于：所述引物包括正向引物和反向引物，所述正向引物的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示，所述反向引物的核苷酸序列如SEQIDNO:2所示；所述探针包括突变型探针，所述突变型探针的核苷酸序列如SEQIDNO:3所示。2.根据权利要求1所述的用于检测人类PIK3CD基因c.3061G>A,p.E1021K位点突变的探针和引物组合，其特征在于：所述正向引物、反向引物和所述突变型探针的摩尔比为1:1:1。3.根据权利要求1所述的用于检测人类PIK3CD基因c.3061G>A,p.E1021K位点突变的探针和引物组合，其特征在于：所述探针还包括野生型探针，所述野生型探针的核苷酸序列如SEQIDNO:4所示。4.根据权利要求3所述的用于检测人类PIK3CD基因c.3061G>A,p.E1021K位点突变的探针和引物组合，其特征在于：所述突变型探针和野生型探针的5’端均标记有荧光基团，3’端均标记有淬灭基团。5.根据权利要求4所述的用于检测人类P...

【专利技术属性】
技术研发人员：王薇，宋红梅，伍建，
申请(专利权)人：中国医学科学院北京协和医院，
类型：发明
国别省市：北京,11