一种纳豆激酶、其表达载体的构建及生产方法技术

本发明专利技术公开了一种纳豆激酶、其表达载体的构建及生产方法。它是以纳豆芽孢杆菌（Bacillus natto）基因组数据为模板，扩增纳豆激酶基因，通过自主复制性质粒和整合型质粒的方法在地衣芽孢杆菌中表达。本发明专利技术还对表达框的启动子和信号肽进行选择，得到一种能够在地衣芽孢杆菌中高效分泌表达的重组菌株，并且实现了在50L发酵罐中的小试生产，产品活力达到15000FU/g。

【技术实现步骤摘要】
一种纳豆激酶、其表达载体的构建及生产方法
本专利技术属于生物
，具体为改变启动子和信号肽的方法提高纳豆激酶在地衣芽孢杆菌中表达的方法，以及在50升发酵罐中小试生产的方法。
技术介绍
纳豆是起源于秦汉时期，是中国和日本的传统发酵豆制品。日本学者须见洋行对纳豆提取物进行研究时发现其具有溶解血栓的作用，并将之命名为纳豆激酶(nattokinase)。纳豆激酶是一种碱性丝氨酸蛋白酶，由一条275个氨基酸残基的多肽链折叠而成，无二硫键，分子量27-28KDa.纳豆激酶在纳豆杆菌中以酶原的形式分泌到胞外，随后信号肽和前肽被切除，形成具有活性的纳豆激酶。纳豆激酶具有显著的溶血栓作用，与尿激酶、链激酶、蚓激酶相比，纳豆激酶更加温和，不会引起出血，半衰期长达8小时。并且该酶可以通过肠壁计入血液，口服就可以发挥溶血栓作用。目前，纳豆激酶的生产是以纳豆杆菌发酵产生纳豆激酶，经过后期的提取纯化得到产品，但是直接发酵的酶活较低，市售的发酵纳豆的活力仅在10FU/g左右，日本营养健康食品协会规定纳豆激酶的每日正常维持量应该不低于2000FU，仅靠使用发酵纳豆不能满足溶血栓的需要，并且发酵纳豆具有特殊的气味，消费者的接受程度不高。从发酵纳豆中提取的纳豆激酶也具有浓烈的特殊气味，感官性质受到较大的影响。目前，纳豆激酶的纯化方法主要有：盐析、超滤、层析过滤以及凝胶过滤。日本生物科学实验室公司有限公司(US730504)以玉米粉和大豆粉为原料，液体深层发酵后，经过壳聚糖絮凝除掉菌体，直径采用超滤膜浓缩，然后添加纤维素冻干得到产品。但是这种方法生产的纳豆激酶气味浓烈。王刚等人通过硫酸铵沉淀和SepHadexG-50凝胶层析过滤的方法得到纯度较高的纳豆激酶，回收率在42.1％。日本、韩国、美国等已有10余家公司生产纳豆激酶的胶囊和片剂。但是在国家食品药品监督进口保健食品数据库中还没有纳豆激酶相关产品的批准文号。这正是我们发展我们自有知识产权纳豆激酶保健品的最佳时机。在我们的前期研究中，我们从传统的发酵纳豆中分离出一株纳豆激酶的高产菌株，利用深层发酵技术中可以很大的提高纳豆激酶的产量，但是发酵液非常粘稠，无法絮凝和进行后续的纯化处理。
技术实现思路
本专利技术的目的在于为了克服以上现有技术的不足而提供一种纳豆激酶、其表达载体的构建及生产方法。通过纳豆激酶表达载体构建，得到能够在地衣芽孢杆菌中高效分泌表达的重组菌株，有效的提高纳豆激酶的活力降低发酵液的黏度，有利于后期的纳豆激酶的分离纯化。本专利技术通过以下技术方案实现：一种纳豆激酶，该纳豆激酶基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。一种纳豆激酶表达载体，包括纳豆激酶基因序列的自主复制型表达质粒，其中纳豆激酶基因序列如SEQIDNO.1所示。以上所述的纳豆激酶表达载体，所述自主复制型表达质粒包括任何能够在地衣芽孢杆菌和大肠杆菌中复制的穿梭质粒。以上所述的纳豆激酶表达载体，所述自主复制型表达质粒包括pWB980、pHP13、pHT01、pHT43、pHT304、pMK3、pMK4、pHCMC04、pHCMC05、pMA5或pBE中的任意一种。以上所述的纳豆激酶表达载体，所述自主复制型表达质粒的启动子可由以下启动子中的任意一种所替代：PamyQ、PaprE、Pveg、PlepA、PnprE、PsodA、PxylA、PahpF、PwprA。一种以上所述的纳豆激酶表达载体的构建方法，通过引物扩增SEQIDNO.1序列，回收扩增产物，连接到T载体，转化大肠杆菌感受态细胞，氨苄青霉素抗性平板筛选后利用限制性内切酶酶切T载体和自主复制型表达质粒，通过DNA连接酶连接，转化大肠杆菌感受态细胞得到。以上所述的纳豆激酶表达载体的构建方法，扩增SEQIDNO.1序列的引物为NK-F：GCTGCCGGAAAAAGCAGTACAGAAAAG和NK-R:TTATTGTGCAGCTGCTTGTACGTTGA。一种整合型纳豆激酶表达载体，其包括整合了以上所述的SEQIDNO.1序列的整合型质粒。以上所述的整合型纳豆激酶表达载体，所述整合型质粒包括任何能够在地衣芽孢杆菌和大肠杆菌中复制的并且能够通过同源重组的方法整合到染色体上的质粒。以上所述的整合型纳豆激酶表达载体，所述整合型质粒为pDG364，pMLK83，pDG1661，pDG1662，pDG1728，pDG1730，pDG1664，pAX01，pSG1170，pSG1729，pMAD，pCBS，pCBS595，pCBS221，pCBS345或pCBS412中的任意一种。以上所述的整合型纳豆激酶表达载体，所述整合型质粒的启动子可由包括以下任意一种的启动子替代：PamyQ、PaprE、Pveg、PlepA、PnprE、PsodA、PxylA、PahpF或PwprA。以上所述的整合型纳豆激酶表达载体，所述整合型质粒的信号肽由包括以下任意一种的信号肽替代：SPnprE、SPamyL、SPaprE、SPbpr、SPwprA或SPvpr。以上所述的整合型纳豆激酶表达载体，所述整合型质粒的启动子可为PamyQ、PaprE、Pveg、PlepA、PnprE、PsodA、PxylA、PahpF或PwprA中任意两个启动子的组合，可以为PamyQ+PaprE、PamyQ+Pveg、PamyQ+PlepA、PamyQ+PnprE、PamyQ+PsodA、PamyQ+PxylA、PamyQ+PahpF、PamyQ+PwprA、PaprE+PvegPaprE+PlepA、PaprE+PnprE、PaprE+PsodA、PaprE+PxylA、PaprE+PahpF、PaprE+PwprA、Pveg+PlepA、Pveg+PnprE、Pveg+PsodA、Pveg+PxylA、Pveg+PahpF、Pveg+PwprA、PlepA+PnprE、PlepA+PsodA、PlepA+PxylA、PlepA+PahpF、PlepA+PwprA、PnprE+PsodA、PnprE+PxylA、PnprE+PahpF、PnprE+PwprA、PsodA+PxylA、PsodA+PahpF、PsodA+PwprA、PxylA+PahpF、PxylA+PwprA、PahpF+PwprA中的任意一种。一种用于生产以上所述的纳豆激酶的培养基，包括种子培养基和发酵基料培养基；其中，种子培养基组分包括：麦芽糖、葡萄糖、大豆粉、磷酸氢二钾、磷酸二氢钠、硫酸镁、氯化钙；具体配方可以为麦芽糖40g/L、葡萄糖10g/L、大豆粉40g/L、磷酸氢二钾1g/L、磷酸二氢钠4g/L、硫酸镁0.5g/L、氯化钙0.2g/L，pH7.6；发酵基料培养基组分包括：葡萄糖，大豆粉，磷酸氢二钾，磷酸二氢钠，硫酸镁，氯化钙；具体配方可以为葡萄糖10g/L，大豆粉40g/L，磷酸氢二钾1g/L，磷酸二氢钠4g/L，硫酸镁0.5g/L，氯化钙0.2g/L，调节pH至7.6。以上所述的纳豆激酶的培养基，还包括发酵补料培养基，其中发酵补料培养基组分包括：麦芽糖浆、葡萄糖、大豆粉；具体配方可以为麦芽糖浆500g/L、葡萄糖10g/L、大豆粉200g/L。一种生产以上所述的纳豆激酶的方法，采用以上所述的培养基进行种子培养和发酵培养，发酵过程中使用磷酸本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种纳豆激酶，其特征在于，该纳豆激酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

【技术特征摘要】
1.一种纳豆激酶，其特征在于，该纳豆激酶基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。2.一种纳豆激酶表达载体，其特征在于，包括纳豆激酶基因序列的自主复制型表达质粒，其中纳豆激酶基因序列如SEQIDNO.1所示。3.根据权利要求2所述的纳豆激酶表达载体，其特征在于，所述自主复制型表达质粒包括任何能够在地衣芽孢杆菌和大肠杆菌中复制的穿梭质粒。4.根据权利要求3所述的纳豆激酶表达载体，其特征在于，所述自主复制型表达质粒包括pWB980、pHP13、pHT01、pHT43、pHT304、pMK3、pMK4、pHCMC04、pHCMC05、pMA5或pBE中的任意一种。5.根据权利要求2所述的纳豆激酶表达载体，其特征在于，所述自主复制型表达质粒的启动子可由以下启动子中的任意一种所替代：PamyQ、PaprE、Pveg、PlepA、PnprE、PsodA、PxylA、PahpF、PwprA。6.权利要求2所述的纳豆激酶表达载体的构建方法，其特征在于，通过引物扩增SEQIDNO.1序列，回收扩增产物，连接到T载体，转化大肠杆菌感受态细胞，氨苄青霉素抗性平板筛选后利用限制性内切酶酶切T载体和自主复制型表达质粒，通过DNA连接酶连接，转化大肠杆菌感受态细胞得到。7.根据权利要求6所述的纳豆激酶表达载体的构建方法，其特征在于，扩增SEQIDNO.1序列的引物为NK-F：GCTGCCGGAAAAAGCAGTACAGAAAAG和NK-R:TTATTGTGCAGCTGCTTGTACGTTGA。8.一种整合型纳豆激酶表达载体，其特征在于，包括整合了权利要求1所述的SEQIDNO.1序列的整合型质粒。9.根据权利要求8所述的整合型纳豆激酶表达载体，其特征在于，所述整合型质粒包括任何能够在地衣芽孢杆菌和大肠杆菌中复制的并且能够通过同源重组的方法整合到染色体上的质粒。10.根据权利要求8所述的整合型纳豆激酶表达载体，其特征在于，所述整合型质粒为pDG364，pMLK83，pDG1661，pDG1662，pDG1728，pDG1730，pDG1664，pAX01，pSG1170，pSG1729，pMAD，pCBS，pCBS595，pCBS221，pCBS345或pCBS412中的任意一种。...

【专利技术属性】
技术研发人员：陆兆新，孟凡强，李金良，吕凤霞，
申请(专利权)人：南京福斯弗瑞生物科技有限公司，南京农业大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32