用于同时检测MTHFR和MTRR基因多态性的产品及其方法和应用技术

本发明专利技术提供了一种用于同时检测MTHFR和MTRR基因多态性的产品及其方法和应用，涉及分子诊断技术领域，本发明专利技术提供的用于同时检测MTHFR和MTRR基因多态性的引物组合物，包括用于检测rs1801133位点、rs1801131位点和rs1801394位点的引物组，可同时检测不同种的基因多态位点，检测全面，同时具有特异性强、灵敏度高的效果，能够将每个位点的三个基因型分别准确区分，并且检测最低浓度能够达到1ng/μl，检测结果可用于临床指导用药。并且，在探针中引入锁核酸修饰，筛选到长度足够短且分型效果佳的探针，同时探针的各项参数符合其设计原则，能够有效提高检测结果精准度，达到最佳的分型效果。

【技术实现步骤摘要】
用于同时检测MTHFR和MTRR基因多态性的产品及其方法和应用
本专利技术涉及分子诊断
，尤其是涉及一种用于同时检测MTHFR和MTRR基因多态性的产品及其方法和应用。
技术介绍
叶酸是一种水溶性维生素，即维生素B9，不能在体内合成，只能从外部摄取。叶酸对体内蛋白质和核酸的合成和以及种氨基酸的代谢具有重要的作用，故叶酸对维持个体健康具有重要的作用。叶酸缺乏可造成胎儿神经管畸形、唐氏综合征，唇腭裂和先天性心脏病等；可造成孕妇妊娠高血压、早产、先兆子痫、习惯性流产和巨幼细胞性贫血等疾病。叶酸补充过量可影响锌的吸收，导致胎儿发育异常和新生儿自闭症等；可增加孕妇结肠腺瘤癌变和乳腺癌发病的风险，掩盖维生素B12缺乏，导致孕妇体虚、神经衰弱和恶性贫血等。所以科学合理补充叶酸是保证个体健康和实现优生优育的重要途径。摄入体内的叶酸需要经过一系列的代谢才能发挥作用。5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶(Methylenetetrahydrofolatereductase，MTHFR)和蛋氨酸合成酶还原酶(Methioninesynthasereductase，MTRR)是叶酸代谢途径中的两种关键酶，两者共同维持体内叶酸的正常代谢。MTHFR催化叶酸代谢途径中5,10-亚甲基四氢叶酸转化成5-甲基四氢叶酸，5-甲基四氢叶酸再通过一系列的催化反应为DNA和蛋白质甲基化提供甲基并使血液中的同型半胱氨酸维持稳定的水平。甲硫氨酸合成酶在维生素B12的辅助下催化5-甲基四氢叶酸和同型半胱氨酸生成四氢叶酸和甲硫氨酸。甲硫氨酸合成酶可能由于维生素B12的氧化而失活，MTRR可以通过甲基化的还原反应而产生有活性的蛋氨酸合成酶。所以MTHFR和MTRR是叶酸代谢的关键酶。MTHFR和MTRR分别由MTHFR基因和MTRR基因编码，MTHFR和MTRR基因的突变将导致其编码的MTHFR和MTRR酶活性降低甚至丧失，进而造成体内叶酸代谢障碍，最终降低叶酸利用率。MTHFR基因常见的突变位点为c.665C>T(rs1801133)和c.1286A>C(rs1801131)，MTRR基因常见的突变位点为c.66A>G(rs1801394)。在中国人群中c.665C>T发生的概率为28％，c.1286A>C发生的概率为4％，c.66A>G发生的概率为6％。c.665C>T和c.1286A>C突变导致MTHFR酶的热稳定和活性大大降低，进而降低叶酸利用能力。c.66A>G突变导致MTRR酶活性降低，引起同型半胱氨酸血浓度升高。总上所述，实现差异个体最佳的叶酸补充剂量需要考虑两个方面，一方面摄入体内的叶酸剂量；另一方面，摄入体内的叶酸利用率，即叶酸的代谢能力。摄入体内叶酸的剂量是由个体的叶酸代谢能力决定，所以检测个体的叶酸代谢能力，根据检测结果指导个体的叶酸补充剂量是科学合理补充叶酸的有效方法。目前，检测叶酸代谢方法主要有Sanger测序法、荧光定量PCR法和芯片杂交法。Sanger测序法实验操作过程比较繁琐，实验周期长，成本高，不适合大量样本的检测。芯片杂交法同样存在实验操作过程比较繁琐，实验周期长，成本高等缺点。荧光定量PCR法通常采用Taqman探针法，TaqManprobe法由于自身的局限性区分度比较差，检测结果存在假阳性或者假阴性。所以建立一种实验操作方便快捷、检测周期短、检测结果精准度高的方法是目前迫切需要解决的问题。有鉴于此，特提出本专利技术。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的在于提供一种用于同时检测MTHFR和MTRR基因多态性的引物组合物，本专利技术的第二个目的在于提供一种用于同时检测MTHFR和MTRR基因多态性的试剂，本专利技术的第三个目的在于提供一种用于同时检测MTHFR和MTRR基因多态性的试剂盒，以至少缓解现有技术中存在的技术问题之一。本专利技术的第四个目的在于提供一种同时检测MTHFR和MTRR基因多态性的方法，该方法操作简便，普适性强，能够节约大量的人力物力，以保证临床的需要。本专利技术的第五个目的在于提供上述的引物组合物、试剂、试剂盒或检测的方法在检测叶酸的代谢能力中的应用。本专利技术提供了一种用于同时检测MTHFR和MTRR基因多态性的引物组合物，所述引物组包括用于检测MTHFR基因rs1801133位点的引物组、用于检测MTHFR基因rs1801131位点的引物组和用于检测MTRR基因rs1801394位点的引物组；所述用于检测MTHFR基因rs1801133位点的引物组包括：如SEQIDNO.1所示的rs1801133位点的上游引物、如SEQIDNO.2所示的rs1801133位点的下游引物、如SEQIDNO.3所示的rs1801133位点的突变型特异性探针和如SEQIDNO.4所示的rs1801133位点的野生型特异性探针；所述用于检测MTHFR基因rs1801131位点的引物组包括：如SEQIDNO.5所示的rs1801131位点的上游引物、如SEQIDNO.6所示的rs1801131位点的下游引物、如SEQIDNO.7所示的rs1801131位点的突变型特异性探针和如SEQIDNO.8所示的rs1801131位点的野生型特异性探针；所述用于检测MTRR基因rs1801394位点的引物组包括：如SEQIDNO.9所示的rs1801394位点的上游引物、如SEQIDNO.10所示的rs1801394位点的下游引物、如SEQIDNO.11所示的rs1801394位点的突变型特异性探针和如SEQIDNO.12所示的rs1801394位点的野生型特异性探针；其中，所述突变型特异性探针和野生型特异性探针均分别修饰有荧光标记；所述rs1801133位点的突变型特异性探针序列的第10位碱基G上修饰有锁核酸，所述rs1801131位点的野生型特异性探针序列的第8位碱基G上修饰有锁核酸。进一步地，所述rs1801133位点的突变型特异性探针的5’端修饰有FAM，3’端修饰有MGB；所述rs1801133位点的野生型特异性探针的5’端修饰有JOE，3’端修饰有MGB；所述rs1801131位点的突变型特异性探针的5’端修饰有JOE，3’端修饰有MGB；所述rs1801131位点的野生型特异性探针的5’端修饰有FAM，3’端修饰有MGB；所述rs1801394位点的突变型特异性探针的5’端修饰有JOE，3’端修饰有MGB；所述rs1801394位点的野生型特异性探针的5’端修饰有FAM，3’端修饰有MGB。本专利技术还提供了一种用于同时检测MTHFR和MTRR基因多态性的试剂，所述试剂包括上述的引物组合物。本专利技术还提供了一种用于同时检测MTHFR和MTRR基因多态性的试剂盒，所述试剂盒包括上述的引物组合物或试剂。进一步地，所述试剂盒还包括2×GenotypingMasterMix、野生型对照、突变型对照、杂合型对照和水；优选地，所述2×GenotypingMasterMix包括2×PCRBuffer、1mMMgCl2、0.4mMdNTP和0.1U/μlMasterTaqHSDNApolymerase。进一步地，所述野生型对照包括本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于同时检测MTHFR和MTRR基因多态性的引物组合物，其特征在于，所述引物组包括用于检测MTHFR基因rs1801133位点的引物组、用于检测MTHFR基因rs1801131位点的引物组和用于检测MTRR基因rs1801394位点的引物组；所述用于检测MTHFR基因rs1801133位点的引物组包括：如SEQ ID NO.1所示的rs1801133位点的上游引物、如SEQ ID NO.2所示的rs1801133位点的下游引物、如SEQ ID NO.3所示的rs1801133位点的突变型特异性探针和如SEQ ID NO.4所示的rs1801133位点的野生型特异性探针；所述用于检测MTHFR基因rs1801131位点的引物组包括：如SEQ ID NO.5所示的rs1801131位点的上游引物、如SEQ ID NO.6所示的rs1801131位点的下游引物、如SEQ ID NO.7所示的rs1801131位点的突变型特异性探针和如SEQ ID NO.8所示的rs1801131位点的野生型特异性探针；所述用于检测MTRR基因rs1801394位点的引物组包括：如SEQ ID NO.9所示的rs1801394位点的上游引物、如SEQ ID NO.10所示的rs1801394位点的下游引物、如SEQ ID NO.11所示的rs1801394位点的突变型特异性探针和如SEQ ID NO.12所示的rs1801394位点的野生型特异性探针；其中，所述突变型特异性探针和野生型特异性探针均分别修饰有荧光标记；所述rs1801133位点的突变型特异性探针序列的第10位碱基G上修饰有锁核酸，所述rs1801131位点的野生型特异性探针序列的第8位碱基G上修饰有锁核酸。...

【技术特征摘要】
1.一种用于同时检测MTHFR和MTRR基因多态性的引物组合物，其特征在于，所述引物组包括用于检测MTHFR基因rs1801133位点的引物组、用于检测MTHFR基因rs1801131位点的引物组和用于检测MTRR基因rs1801394位点的引物组；所述用于检测MTHFR基因rs1801133位点的引物组包括：如SEQIDNO.1所示的rs1801133位点的上游引物、如SEQIDNO.2所示的rs1801133位点的下游引物、如SEQIDNO.3所示的rs1801133位点的突变型特异性探针和如SEQIDNO.4所示的rs1801133位点的野生型特异性探针；所述用于检测MTHFR基因rs1801131位点的引物组包括：如SEQIDNO.5所示的rs1801131位点的上游引物、如SEQIDNO.6所示的rs1801131位点的下游引物、如SEQIDNO.7所示的rs1801131位点的突变型特异性探针和如SEQIDNO.8所示的rs1801131位点的野生型特异性探针；所述用于检测MTRR基因rs1801394位点的引物组包括：如SEQIDNO.9所示的rs1801394位点的上游引物、如SEQIDNO.10所示的rs1801394位点的下游引物、如SEQIDNO.11所示的rs1801394位点的突变型特异性探针和如SEQIDNO.12所示的rs1801394位点的野生型特异性探针；其中，所述突变型特异性探针和野生型特异性探针均分别修饰有荧光标记；所述rs1801133位点的突变型特异性探针序列的第10位碱基G上修饰有锁核酸，所述rs1801131位点的野生型特异性探针序列的第8位碱基G上修饰有锁核酸。2.根据权利要求1所述的引物组合物，其特征在于，所述rs1801133位点的突变型特异性探针的5’端修饰有FAM，3’端修饰有MGB；所述rs1801133位点的野生型特异性探针的5’端修饰有JOE，3’端修饰有MGB；所述rs1801131位点的突变型特异性探针的5’端修饰有JOE，3’端修饰有MGB；所述rs1801131位点的野生型特异性探针的5’端修饰有FAM，3’端修饰有MGB；所述rs1801394位点的突变型特...

【专利技术属性】
技术研发人员：李威，张云静，
申请(专利权)人：生工生物工程上海股份有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31