特异抑制肺癌PPARd基因表达的shRNA慢病毒表达载体及其构建方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种特异抑制肺癌PPARd基因表达的shRNA慢病毒表达载体及其构建方法与应用，属于基因工程技术领域。本发明专利技术提供的靶向PPARd的shRNA寡核苷酸序列插入pLVX‑shRNA2‑Puro表达载体构建得到的shRNA慢病毒表达载体具有转染效率高，可持续、高效、稳定、特异地沉默肺癌PPARd基因表达的优点，抑制效果好，可用于肺癌研究，肺癌药物筛选与肺癌基因治疗等方面。

【技术实现步骤摘要】
特异抑制肺癌PPARd基因表达的shRNA慢病毒表达载体及其构建方法与应用
本专利技术属于基因工程
，特别涉及一种特异抑制肺癌PPARd基因表达的shRNA慢病毒表达载体及其构建方法与应用。
技术介绍
PPARD是过氧化物酶体增殖物激活受体家族重要成员，在人体内各组织，在小肠、心脏和脂肪组织等脂代谢相关组织中表达量较高，在巨噬细胞和皮肤中表达亦存在较高表达。PPARD可能参与糖脂代谢、肌肉能量代谢、胚胎细胞发育、伤口愈合和炎症反应等。此外，在多种肿瘤中均存在PPARD的表达，包括乳腺癌、肺癌、神经胶质瘤、结肠癌、肝癌、胰腺癌、前列腺癌、甲状腺癌等，并有研究认为PPARD表达差异与肿瘤的分期，预后有关。大多数研究表明，PPARD是肺癌的危险因素。PPARD在肺腺癌中有促进癌细胞生长，促进新生血管生成和抗凋亡的作用。RNA干扰技术可以高效特异沉默靶基因表达，广泛应用于特异抑制基因的表达及其功能研究。本专利利用该技术建立PPARD基因沉默肺癌细胞，用于肺癌发生，肺癌药物筛选与肺癌基因治疗等方面的研究。目前关于PPARD与肺癌的研究及相关产品非常少，利用RNAi技术建立PPARD基因沉默肺癌细胞株并用于肺癌研究还没有报道过。
技术实现思路
本专利技术的目的在于为解决肺癌研究、肺癌药物筛选及肺癌基因治疗存在的问题，提供一种特异抑制肺癌PPARd基因表达的shRNA慢病毒表达载体及其构建方法与应用。本专利技术将包含BamHI酶切位点和EcoRI酶切位点的shRNA寡核苷酸序列插入pLVX-shRNA2-Puro表达载体的多克隆位点中可成功构建靶向PPARd基因的shRNA慢病毒表达载体，利用慢病毒感染肺癌细胞，并整合靶向PPARd基因的shRNA至肺癌细胞的基因组中，使靶向PPARd基因的shRNA长期、稳定表达，产生高效、持久、特异抑制PPARd基因表达效果，从而完成本专利技术。本专利技术的目的通过下述技术方案实现：一种特异抑制肺癌PPARd基因表达的shRNA慢病毒表达载体，具体包括：pLVX-shRNA2-Puro表达载体和靶向PPARd基因的shRNA寡核苷酸序列；所述靶向PPARd基因的shRNA寡核苷酸序列包含靶核苷酸序列GTGGAAGCAGTTGGTGAAT和靶核苷酸序列互补序列ATTCACCAACTGCTTCCAC。所述靶向PPARd基因的shRNA寡核苷酸序列正向插入所述pLVX-shRNA2-Puro表达载体的多克隆位点中。所述pLVX-shRNA2-Puro表达载体包括PLVX-shRNA2-Puro表达载体的基本序列、抗性基因序列、多克隆位点序列、启动子序列。所述多克隆位点包括BamHI酶切位点和EcoRI酶切位点。所述靶向PPARd基因的shRNA寡核苷酸序列由BamHI酶切位点+靶核苷酸序列+茎环结构序列+靶核苷酸序列互补序列+终止位点序列+EcoRI酶切位点组成。所述茎环结构序列优选序列为TTCAAGAGA；所述终止位点序列优选为RNAPolyIII聚合酶转录中止位点TTTTTT；所述靶向PPARd基因的shRNA寡核苷酸序列优选为正向序列PPARD-T1：gatccGTGGAAGCAGTTGGTGAATTTCAAGAGAATTCACCAACTGCTTCCACTTTTTT和反向互补序列PPARD-D1：aattAAAAAAGTGGAAGCAGTTGGTGAATTCTCTTGAAATTCACCAACTGCTTCCACg。上述特异抑制肺癌PPARd基因表达的shRNA慢病毒表达载体的构建方法，包括以下步骤：(1)shRNA设计与合成设计PPARDshRNA基本结构为：BamHI酶切位点+靶核苷酸序列+茎环结构(TTCAAGAGA)+靶序列互补序列+RNAPolyIII聚合酶转录中止位点(TTTTTT)+EcoRI酶切位点六个区域，分别命名为PPARD-T1和PPARD-D1；序列如下所示：PPARD-T1：gatccGTGGAAGCAGTTGGTGAATTTCAAGAGAATTCACCAACTGCTTCCACTTTTTT；PPARD-D1：aattAAAAAAGTGGAAGCAGTTGGTGAATTCTCTTGAAATTCACCAACTGCTTCCACg；(2)shRNA干扰载体构建pLVX-shRNA2-Puro载体用EcoR1和BamH1双酶切回收后，对PPARDshRNA进行退火处理；(3)重组干扰载体构建：退火后PPARDshRNA与PLVX-shRNA2-Puro相连接，取连接产物转化感受态细胞培养；(4)阳性克隆子质粒抽提与鉴定：取培养的连接产物感受态细胞，提取重组质粒；采用双酶切和测序确认获得目标shRNA慢病毒表达载体。步骤(3)中所述感受态细胞优选为JM107感受态细胞。步骤(4)中所述双酶切优选为EcoR1和Kpn1双酶切、或BamH1和Kpn1双酶切中的一种。所述特异抑制肺癌PPARd基因表达的shRNA慢病毒表达载体在肺癌药物筛选中应用。所述特异抑制肺癌PPARd基因表达的shRNA慢病毒表达载体在制备肺癌基因药物中应用。本专利技术相对于现有技术具有如下的优点及效果：采用上述技术方案，本专利技术提供的靶向PPARd的shRNA寡核苷酸序列插入pLVX-shRNA2-Puro表达载体构建得到的shRNA慢病毒表达载体具有转染效率高，可持续、高效、稳定、特异地沉默肺癌PPARd基因表达的优点，抑制效果好，可用于肺癌研究，肺癌药物筛选与肺癌基因治疗等方面。附图说明图1是EcoR1和Kpn1，BamH1和Kpn1分别进行双酶切鉴定(1，3，5分别为：PPARD-1，2，3质粒KpnI，EcoRI双酶切；2，4，6分别为：PPARD-1，2，3质粒KpnI，BamHI双酶切)；图2是QPCR检测PPARD相对表达量；图3是QPCR检测肺癌细胞PPARd基因表达变化；图4是WB检测PPARd蛋白质在肺癌细胞中表达。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术作进一步详细的描述，但本专利技术的实施方式不限于此。实施例1：靶向PPARd基因慢病毒shRNA干扰载体的构建(1)ShRNA设计与合成针对ppard基因序列，利用公用网站中提供的RNA干扰序列设计原则，设计三对RNA干扰靶点序列，根据公司多年的设计经验和设计软件进行评估测定，选择最佳的动力学参数靶点进入后续实验流程，除了自行设计的shRNA靶点序列之外，我们也使用一些RNA干扰实验中公认序列(shRNAc-T和shRNAc-D)。PPARDshRNA基本结构为：BamHI酶切位点+靶核苷酸序列+茎环结构(TTCAAGAGA)+靶序列互补序列+RNAPolyIII聚合酶转录中止位点(TTTTTT)+EcoRI酶切位点六个区域，分别命名为PPARD-T1和PPARD-D1，PPARD-T2和PPARD-D2，PPARD-T3和PPARD-D3，shRNAc-T和shRNAc-D。具体序列见如下表1所示：表1.PPARD基因shRNA序列表(2)shRNA干扰载体构建pLVX-shRNA2-Puro用EcoR1和BamH1双酶切，37℃酶切30min，并进行琼脂糖凝胶电泳，用DNA凝胶回收试剂盒回收；酶切反应体系如下表2所示：表2.酶切反应成分表PPA本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种特异抑制肺癌PPARd基因表达的shRNA慢病毒表达载体，其特征在于：具体包括：pLVX‑shRNA2‑Puro表达载体和靶向PPARd基因的shRNA寡核苷酸序列；所述靶向PPARd基因的shRNA寡核苷酸序列包含靶核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示和靶核苷酸序列互补序列如SEQ ID NO 2所示。

【技术特征摘要】
1.一种特异抑制肺癌PPARd基因表达的shRNA慢病毒表达载体，其特征在于：具体包括：pLVX-shRNA2-Puro表达载体和靶向PPARd基因的shRNA寡核苷酸序列；所述靶向PPARd基因的shRNA寡核苷酸序列包含靶核苷酸序列如SEQIDNO1所示和靶核苷酸序列互补序列如SEQIDNO2所示。2.根据权利要求1所述的特异抑制肺癌PPARd基因表达的shRNA慢病毒表达载体，其特征在于：所述靶向PPARd基因的shRNA寡核苷酸序列正向插入所述pLVX-shRNA2-Puro表达载体的多克隆位点中。3.根据权利要求1所述的特异抑制肺癌PPARd基因表达的shRNA慢病毒表达载体，其特征在于：所述pLVX-shRNA2-Puro表达载体包括PLVX-shRNA2-Puro表达载体的基本序列、抗性基因序列、多克隆位点序列、启动子序列；所述多克隆位点包括BamHI酶切位点和EcoRI酶切位点。4.根据权利要求1所述的特异抑制肺癌PPARd基因表达的shRNA慢病毒表达载体，其特征在于：所述靶向PPARd基因的shRNA寡核苷酸序列由BamHI酶切位点+靶核苷酸序列+茎环结构序列+靶核苷酸序列互补序列+终止位点序列+EcoRI酶切位点组成。5.根据权利要求4所述的特异抑制肺癌PPARd基因表达的shRNA慢病毒表达载体，其特征在于：所述茎环结构序列为TTCAAGAGA。6.根据权利要求4所述的特异抑制肺癌PPARd基因表达的shRNA慢病毒表达载体，其特征在于：所述终止位点序列为RNAPolyIII聚合酶转录中止位点TTTTTT。7.根据权利要求1所述的特异抑制肺癌PPARd基因表达的shRN...

【专利技术属性】
技术研发人员：袁建辉，张洪，谢妮，左然，任晓虎，吴德生，李萍，毛吉炎，
申请(专利权)人：深圳市南山区疾病预防控制中心，
类型：发明
国别省市：广东,44