检测人类肥胖易感基因多态性的探针及试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了检测人类肥胖易感基因多态性的探针，包括针对FTO基因rs1421085位点的第一探针AATCAATGTCATGCCTTAGGA、针对APOA5基因rs662799位点的第二探针GGCAAATCTCACTTTCGCTCCAG、针对FABP2基因rs1799883位点的第三探针GAATCAAGCGCTTTTCGAAAC、针对ADRB3基因rs4994位点的第四探针GGCCATCGCCTGGACTCCGA。本发明专利技术属于生物技术领域，本发明专利技术提供一种检测人类肥胖易感基因多态性的探针，并进而提供含该探针的试剂盒，实现了人类肥胖易感基因多态性的多重、高效检测。高效检测。高效检测。

【技术实现步骤摘要】
检测人类肥胖易感基因多态性的探针及试剂盒


[0001]本专利技术属于生物
，尤其涉及检测人类肥胖易感基因多态性的探针及试剂盒。

技术介绍

[0002]肥胖是当今世界上最大的健康问题之一，全世界超重和肥胖人口超过20亿，我国成人中超重或肥胖的比例也已经超过50％。饮食习惯及遗传背景都与人群的肥胖情况密切相关。多个欧美人群中的全基因关联研究表明FTO(fat mass and obesity associated gene，脂肪量与肥胖相关基因)、ADRB3等基因与肥胖的发生密切相关。但针对中国人群的肥胖易感基因的研究较少，原因之一是没有很合适的方便、精准、低成本的检测方法。
[0003]目前市场上并没有用于大规模人群肥胖基因风险位点筛查的试剂盒，传统的PCR
‑
测序法则存在步骤繁琐、检测成本高等缺点，不适用于大规模人群筛查，使用基因芯片或基因测序法进行人群筛查则成本过高。其中，基因芯片法的优点是通量大，但是有成本比PCR法高，且操作复杂耗时长，有非特异性信号，灵敏度和重复性较差的缺点。此外，还有各种PCR法，如PCR
‑
Sanger测序法的优点是检测准确性高，设计简单但是通量较低，操作复杂，需要扩增，电泳，测序等多个步骤。
[0004]探针熔解曲线通过单链探针与扩增产物特异杂交的方式来提供熔解曲线。取代双链DNA自身在从低温到高温中的熔解过程，利用荧光探针与不同的单链靶序列杂交后形成的双链DNA熔解特征的差异来区分不同的靶序列。此技术无需染料，但要求探针在从低温到高温过程中，伴随着它与单链靶序列的结合与分离状态具有明显的荧光信号的变化，目前已常用于基因突变分析。对要检测的突变位点设计特异性探针，基于探针与互补碱基和非互补碱基形成之间的解离温度不同而将纯合野生型、杂合性和纯合突变型区分开来。
[0005]探针熔解曲线通过单链探针与扩增产物特异杂交的方式来提供熔解曲线。取代双链DNA自身在从低温到高温中的熔解过程，利用荧光探针与不同的单链靶序列杂交后形成的双链DNA熔解特征的差异来区分不同的靶序列。对要检测的突变位点设计特异性探针，基于探针与互补碱基和非互补碱基形成之间的解离温度不同而将纯合野生型、杂合性和纯合突变型区分开来。与基因芯片法相比操作简单耗时短，成本低，灵敏度高且重复性好；与PCR
‑
Sanger测序法相比，操作更加简单，通量更高。相较下探针熔解曲线法的缺点是探针设计难，有些SNP由于附近的GC含量及自身发夹结构的问题，导致设计困难。
[0006]中国专利申请CN 105296619 A公开了中国人群肥胖易感基因SNP分型用试剂盒及其使用方法，该专利申请选择有密切相关性的12个SNP位点作为筛查目标，在一定程度上弥补目前现有SNP分型筛查方法的不足，但仍无法实现有关人类肥胖易感基因位点的多重、高效检测。

技术实现思路

[0007]为解决现有技术中存在的问题，本专利技术选择人类4个常见的肥胖易感基因位点
(FTO基因rs1421085位点、APOA5基因rs662799位点、FABP2基因rs1799883位点、ADRB3基因rs4994位点)进行多态性检测研究，通过调整探针的位置及其碱基组合，不断优化探针的Tm值、GC含量及2级发夹结构，完成了检测人类肥胖易感基因多态性的探针设计与优化。本专利技术提供一种检测人类肥胖易感基因多态性的探针，并进而提供含该探针的试剂盒，实现了人类肥胖易感基因多态性的多重、高效检测。
[0008]本专利技术的目的将通过下面的详细描述来进一步说明。
[0009]本专利技术提供检测人类肥胖易感基因多态性的探针，包括针对FTO基因rs1421085位点的第一探针AATCAATGTCATGCCTTAGGA，即SEQ ID NO:1；针对APOA5基因rs662799位点的第二探针GGCAAATCTCACTTTCGCTCCAG，即SEQ ID NO:2；针对FABP2基因rs1799883位点的第三探针GAATCAAGCGCTTTTCGAAAC，即SEQ ID NO:3；针对ADRB3基因rs4994位点的第四探针GGCCATCGCCTGGACTCCGA，即SEQ ID NO:4。
[0010]优选地，所述第一探针的5
’
端用FAM荧光激发基团修饰，3
’
端用BHQ1荧光淬灭基团修饰。
[0011]优选地，所述第二探针的5
’
端用HEX荧光激发基团修饰，3
’
端用BHQ1荧光淬灭基团修饰。
[0012]优选地，所述第三探针的5
’
端用Texas Red荧光激发基团修饰，3
’
端用BHQ2荧光淬灭基团修饰。
[0013]优选地，所述第四探针的5
’
端用Cy5荧光激发基团修饰，3
’
端用BHQ2荧光淬灭基团修饰。
[0014]此外，本专利技术还提供检测人类肥胖易感基因多态性的试剂盒，包括PCR MIX混合液管，该混合液管包括所述的探针。
[0015]本专利技术提供的试剂盒相关检测方法学的设计和验证步骤如下：
[0016]a.分析FTO基因rs1421085位点、APOA5基因rs662799位点、FABP2基因rs1799883位点、ADRB3基因rs4994位点这4个基因位点所在序列的上下30bp，分别设计一条探针序列；
[0017]b.根据设计出来的探针序列，设计对应的野生型
‑
未突变的Target
‑
TW，突变型的Target
‑
TM；
[0018]c.配制熔解曲线试剂，模拟人的基因型别，验证探针与Target(靶序列)的熔解曲线，得出可以达到分型的Tm值；如果得不出合格的Tm值，则需要重新设计探针；
[0019]d.分析这4个基因位点所在序列的上下150bp，设计出与探针不会有发夹结构的引物对；
[0020]e.将引物，探针，PCR试剂混合，多重不对称扩增，根据熔解曲线的Tm值，筛选出合适的引物对；
[0021]f.上述验证无误后，提取样本DNA，将所述样本DNA与本专利技术设计的引物对，探针试剂，PCR试剂混合，进行多重不对称荧光定量PCR扩增，得到熔解曲线的Tm值；
[0022]g.根据所述的Tm值，判断所述样本FTO基因rs1421085位点、APOA5基因rs662799位点、FABP2基因rs1799883位点、ADRB3基因rs4994位点的基因型。
[0023]优选地，所述检测人类肥胖易感基因多态性的试剂盒，还包括盒体、海绵隔板、FAT
‑
GENE标准品对照品管和FAT
‑
GENE阴性对照品管；所述海绵隔板嵌入在所述盒体内，所述盒体含盒盖，所述PCR MIX混合液管、所述FAT
‑
GENE标准品对照品管、所述FAT
‑
GENE阴性...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.检测人类肥胖易感基因多态性的探针，其特征在于：包括针对FTO基因rs1421085位点的第一探针AATCAATGTCATGCCTTAGGA，即SEQ ID NO:1；针对APOA5基因rs662799位点的第二探针GGCAAATCTCACTTTCGCTCCAG，即SEQ ID NO:2；针对FABP2基因rs1799883位点的第三探针GAATCAAGCGCTTTTCGAAAC，即SEQ ID NO:3；针对ADRB3基因rs4994位点的第四探针GGCCATCGCCTGGACTCCGA，即SEQ ID NO:4。2.根据权利要求1所述的检测人类肥胖易感基因多态性的探针，其特征在于：所述第一探针的5
’
端用FAM荧光激发基团修饰，3
’
端用BHQ1荧光淬灭基团修饰。3.根据权利要求1或2所述的检测人类肥胖易感基因多态性的探针，其特征在于：所述第二探针的5
’
端用HEX荧光激发基团修饰，3
’
端用BHQ1荧光淬灭基团修饰。4.根据权利要求1或2所述的检测人...

【专利技术属性】
技术研发人员：李勇，鲁晶晶，
申请(专利权)人：深圳市南山区疾病预防控制中心，
类型：发明
国别省市：