SMN1基因拷贝数变异检测试剂盒制造技术

本发明专利技术提供了一种SMN1基因拷贝数变异检测试剂盒，具体地本发明专利技术开发了一种基于数字PCR平台，快速定性检测人脊髓性肌萎缩症(spinal muscular atrophy，SMA)关键致病基因，运动神经元存活基因SMN1第7外显子缺失的方法、引物、探针及其试剂盒，实验结果表明本发明专利技术的检测体系具有极高的灵敏度和准确性。明的检测体系具有极高的灵敏度和准确性。明的检测体系具有极高的灵敏度和准确性。

【技术实现步骤摘要】
SMN1基因拷贝数变异检测试剂盒


[0001]本专利技术属于生物
，具体地说，本专利技术涉及一种SMN1基因拷贝数变异检测试剂盒。

技术介绍

[0002]脊髓肌萎缩症(SMA)是一种常染色体隐性、渐进性神经退行性疾病，主要表现为脊髓腹侧灰角的神经元细胞变性导致的对称性肌无力和肌萎缩。SMA的发病率约为万分之一，是导致婴儿遗传死亡的最常见原因之一，而中国人群SMA致病基因的携带者频率是1/42。根据发病年龄和临床表现的严重程度，SMA可分为三种类型：Ⅰ型病称为严重型，出生后6个月内发病，患儿无法坐立，通常在两岁以内死亡；Ⅱ型又称为中间型，出生后6
‑
18个月内发病，患儿无法站立和行走，存活期视呼吸道并发症的情况而定；Ⅲ型病于出生18个月后发病，患儿能独立行走，病情进展缓慢，可存活至成年。
[0003]运动神经元存活基因SMN1和SMN2是与SMA相关的两个重要基因。其中SMN1是合成运动神经蛋白的关键基因，其7号外显子纯合及杂合缺失是SMA的主要病因。两位SMA携带者(杂合缺失)的结合是诞生SMA患者可能性最大的情况，因此婚前或孕前检查是非常必要的。对SMN1基因拷贝数的检测是预防及诊断SMA最准确的方法之一。
[0004]目前SMN1基因常用的检测包括限制性片段长度多态性分析(PCR
‑
RLFP)、多重探针连接扩增技术(MLPA)、实时荧光定量PCR、变性高效液相色谱(DHPLC)等检测方法。这些方法虽然能定性检测出SMN1基因的缺失，但不能对拷贝数进行绝对定量。
[0005](1)限制性片段长度多态性分析(PCR
‑
RLFP)，首先对SMN1基因进行PCR扩增，然后对扩增产物进行酶切处理。SMN1和SMN2基因间的碱基差导致其限制性酶切位点不同，根据酶切后电泳条带的位置变化即可判断SMN1基因是否存在缺失。该方法简单易行，因而一直沿用，但由于该方法通过电泳位置进行诊断，无法检测基因拷贝数变化，因此无法检出仅含有1个SMN1基因的SMA携带者。
[0006](2)多重探针连接扩增技术(MLPA)，针对靶序列设计一对特异性探针，当DNA双链变性解旋后，两探针与单链靶基因上相邻位点互补杂交，并通过特定的DNA连接酶结合探针，保证探针分子可以发生特异性扩增并相互连接成一条完整的核酸单链。通过毛细管电泳结合软件分析峰形图即可判断靶基因的拷贝数异常或突变。该技术特异性强、灵敏度高，检测的同时还可实现定量分析。但其操作繁琐，耗时较长，成本高昂，同时对技术人员的操作能力和分析水平均有较高要求。
[0007](3)实时荧光定量PCR，PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭剂。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭剂吸收；PCR扩增时，根据FRET原理，Taq酶的5
’
端
‑3’
端外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭剂分离，荧光监测系统可接收到荧光信号，荧光信号的累积与基因模板的拷贝数相关。该方法与MLPA结果的准确性和灵敏度相近且操作更简单，但定量检测时依赖标准曲线，定量准确性较差且容易出现假阳性。
[0008](4)变性高效液相色谱(DHPLC)，有两种常用的检测模式。一是半变性模式检测基因突变，半变性突变检测原理是基于未解链的和部分解链的双链在部分失活条件下具有不同保留时间的性质，即由于同源双链和异源双链在其解链特征的差异，使得它们在色谱柱中的保留时间不同而得以区分。二是非变性模式检测片段大小，检测原理是在不变性温度条件下，高效液相色谱仪类似于凝胶电泳仪，可分离分子量不同的双链分子，但其灵敏度远远高于凝胶电泳，这种模式下的检测类似于限制性长度多态性分析。DHPLC的灵敏度和通量较高，且通过峰形图借助内标基因可以进行准确定量，但由于实验流程同时涉及了DNA变性和复性的PCR扩增和液相检测，流程时间过长，且对PCR的循环数要求进行精确的控制。

技术实现思路

[0009]本专利技术的目的在于提供了一种基于数字PCR平台，快速定性检测人脊髓性肌萎缩症(spinal muscular atrophy，SMA)关键致病基因，运动神经元存活基因SMN1第7外显子缺失的方法、引物、探针及其试剂盒。
[0010]在本专利技术的第一方面，提供了一种用于检测SMN1基因拷贝数变异的引物对集，所述引物对集包括：
[0011]第一引物对，所述第一引物对包括如SEQ ID NO.1所示的正向引物；以及，如SEQ ID NO.2所示的反向引物。
[0012]在另一优选例中，所述引物对集还包括：
[0013]第二引物对，所述第二引物对组包括如SEQ ID NO.3所示的正向引物；和，如SEQ ID NO.4所示的反向引物。
[0014]本专利技术的第二方面，提供了一种检测SMN1基因拷贝数变异的探针集，所述探针集包括：SEQ ID NO.5所示的第一探针。
[0015]在另一优选例中，所述探针集还包括：SEQ ID NO.6所示的第二探针。
[0016]在另一优选例中，所述第一探针的5
’
端包含有荧光报告基团；和/或，所述第一探针的3
’
端包含有荧光淬灭基团。
[0017]在另一优选例中，所述第二探针的5
’
端包含有荧光报告基团；和/或，所述第二探针的3
’
端包含有荧光淬灭基团。
[0018]在另一优选例中，所述第一探针标记的荧光报告基团不同于所述第二探针标记的荧光报告基团。
[0019]本专利技术的第三方面，提供了一种用于检测SMN1基因拷贝数变异的试剂盒，所述试剂盒包括本专利技术第一方面所述的引物对集。
[0020]在另一优选例中，所述试剂盒还包括本专利技术第二方面所述的探针集。
[0021]在另一优选例中，所述试剂盒包括第一容器，所述第一容器内包含引物探针混合液，所述引物探针混合液中包含SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、和SEQ ID NO.6所示的多核苷酸序列。
[0022]在另一优选例中，所述试剂盒包括第二容器，所述第二容器内包含数字PCR预混液；优选地，所述数字PCR预混液包含选自下组的一种或多种组分：dNTP混合物、热启动Taq酶、RNase抑制剂。
[0023]在另一优选例中，所述试剂盒还包括第三容器，所述第三容器内包含阳性对照。
[0024]在另一优选例中，所述试剂盒还包括第四容器，所述第四容器内包含阴性对照。优选地，所述阴性对照为正常人全血DNA。
[0025]本专利技术的第四方面，提供了一种检测SMN1基因拷贝数变异的方法，所述方法包括步骤：
[0026](1)提供待检测对象的核酸样本；
[0027](2)制备数字PCR反应体系并进行数字PCR检测：
[0028]其中，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于检测SMN1基因拷贝数变异的引物对集，其特征在于，所述引物对集包括：第一引物对，所述第一引物对包括如SEQ ID NO.1所示的正向引物；以及，如SEQ ID NO.2所示的反向引物；优选地，所述引物对集还包括：第二引物对，所述第二引物对组包括如SEQ ID NO.3所示的正向引物；和，如SEQ ID NO.4所示的反向引物。2.一种检测SMN1基因拷贝数变异的探针集，其特征在于，所述探针集包括：SEQ ID NO.5所示的第一探针；优选地，所述探针集还包括：SEQ ID NO.6所示的第二探针。3.一种用于检测SMN1基因拷贝数变异的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的引物对集。4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括权利要求2所述的探针集。5.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括第一容器，所述第一容器内包含引物探针混合液，所述引物探针混合液中包含SEQ ID NO.1、SEQ ID NO...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱小亚，蒋析文，潘翠园，玉小静，
申请(专利权)人：广州达安基因股份有限公司，
类型：发明
国别省市：