一种提取RNA的试剂盒及应用方法技术

本发明专利技术属于分子生物学领域，特别涉及一种磁珠法提取核糖核酸(RNA)的试剂盒及提取方法，所述试剂盒包括试剂：组织消化液、裂解液、蛋白酶K、DNase Ⅰ、DNase ⅠBuffer、核酸、提取磁珠、洗涤液Ⅰ、洗涤液Ⅱ、洗脱液；本发明专利技术还公开了利用所述试剂盒提取组织RNA的方法。本发明专利技术试剂盒及方法提高了RNA提取产量、纯度、及RNA完整性，同时可实现自动化提取，实现多样本同时进行平行检测，节约人力、时间成本。

【技术实现步骤摘要】
一种提取RNA的试剂盒及应用方法
本专利技术属于分子生物学领域，特别涉及一种提取生物组织样本中的核糖核酸(RNA)的试剂盒及提取方法。
技术介绍
RNA是以DNA的一条链为模板，以碱基互补配对原则，转录而形成的一条单链，主要功能是实现遗传信息在蛋白质上的表达，是遗传信息向表型转化过程中的桥梁。RNA提取容易降解，RNA容易降解有内在因素也有外在因素，从自身结构来说RNA是单链分子，本身就很不稳定，另外，RNA分子2’位置上有游离的羟基，易形成2’，3’-环形磷酸盐中间产物，易分解。从外在因素来看，就是RNase无处不在，并且RNase本身热稳定性高、不容易失活，所以在RNA提取过程中，凡是与RNA接触到的器皿都必须是RNase-free的，例如DEPC处理失活RNase、购买RNase-free的实验耗材。RNA提取最常用的是TRIzol法和离心柱试剂盒法，二者各有优劣，可根据研究目的进行选择。TRIzol法优点：提取成本低，为最经典常见的RNA提取方法，缺点：操作步骤繁琐、耗时长，提取RNA纯度不高，而且所用试剂大多有毒，对操作人员身体和环境可能造成危害。试剂法中较常见的过柱法则是结合TRIzol法，加入氯仿分层后取水相RNA过柱提取，较TRIzol法提取RNA纯度高，但是离心等步骤过于繁琐，试剂对操作人员和环境也同样有害。磁珠法提取RNA,实验过程操作快，加样准确且可以实现自动化提取，但目前国内大多磁珠法提取依然未脱离TRIzol法，与过柱法类似，取加入氯仿分层后的水相，进行核酸吸附。由此可见，现有技术亟待改善。
技术实现思路
鉴于此，有必要针对上述问题提供一种磁珠法提取RNA的试剂盒及应用方法。本专利技术是通过以下技术方案实现的：一种提取RNA的试剂盒，试剂包括：核酸提取磁珠、裂解液、蛋白酶K溶液、DNaseⅠ、DNaseⅠBuffer、洗涤液Ⅰ、洗涤液Ⅱ、洗脱液；所述裂解液包括：终浓度为1～5mol/L的异硫氰酸胍、终浓度为5～10mmol/L的柠檬酸钠、终浓度为0.5mol/L～2mol/L氯化锂、体积百分比为0.5～5％的Tween-20、体积百分比为0.10％～2％的乙酸钾、终浓度为0.05mg～1mg/ml的糖原，终浓度为10mmol/L～100mmol/L的DTT；优选地，所述裂解液包括：终浓度为3mol/L的异硫氰酸胍、终浓度为5mmol/L的柠檬酸钠、终浓度为2mol/L氯化锂、体积百分比为3～5％的Tween-20、终浓度为0.5mg/ml的糖原，终浓度为50mmol/L的DTT；所述裂解液中LiCl能够促进磁珠对小分子RNA的吸附效果，同时，裂解液中的糖原具有显著的RNA助沉效果，两者共同作用，可以显著提高磁珠提取RNA的产量，尤其是提高了吸附小片段RNA的能力，避免了MicroRNA的损失。所述裂解液中乙酸钾能够去除样本中多糖组分，有助于得到高纯度RNA。进一步的，所述试剂盒还包括组织消化液。所述组织消化液包括：终浓度为10～50mmol/L的Tris-Hcl、终浓度10～20mmol/LCaCL2，终浓度为10mmol/L～100mmol/L的DTT；优选的，所述组织消化液包括：终浓度为20mmol/L的Tris-Hcl，终浓度为50mmol/L的DTT；所述消化液主要作用是辅助裂解液消化组织，降低裂解液中胍盐浓度，同时消化液中CaCl2是一种蛋白酶K活性增强剂，可以促进蛋白酶K对组织的消化能力，提高RNA提取产量。所述消化液中DTT是一种强还原剂，还原RNA酶中二硫键，抑制RNA酶，消化液中和裂解液组分，促进蛋白酶K消化组织。进一步的，所述蛋白酶K溶液，浓度为5～10mg/ml；优选地，所述蛋白酶K溶液浓度为10mg/ml。进一步的，所述洗涤液Ⅰ包括：终浓度0.1～0.5mol/L异硫氰酸胍、终浓度50～100mmol/L的Tris-HCl、终浓度为5～10mmol/L的EDTA、体积百分比浓度为0.5％～5％的Tween-20、终浓度为0.1～1mol/L的可溶性盐LiCl、终浓度为10mmol/L～100mmol/L的DTT；体积百分比浓度30～80％的异丙醇；优选的，所述洗涤液Ⅰ包括：终浓度0.25mol/L异硫氰酸胍、终浓度100mmol/L的Tris-Hcl、终浓度为10mmol/L的EDTA、体积百分比浓度为3％的Tween-20、终浓度为0.5mol/L的可溶性盐LiCl、终浓度为50mmol/L的DTT；体积百分比浓度60％的异丙醇；所述异硫氰酸胍、DTT可强烈抑制RNA酶，Tween-20作为去污剂，去除残留的蛋白及杂质，LiCl可以促进磁珠与RNA吸附，避免了清洗带来的RNA损失。经过洗涤液Ⅰ处理后，可提高核酸纯度。进一步的，所述洗涤液Ⅱ包括：终浓度为5～20mmol/L的Tris-HCL、体积百分比浓度70～80％的乙醇；优选地，所述洗涤液Ⅱ包括：终浓度为10mmol/L的Tris-HCL、体积百分比浓度75％的乙醇，pH8.0。进一步的，所述DNaseⅠ浓度为1～3U/μl。进一步的，所述为DNaseⅠBuffer包括：终浓度为5～20mmol/LTris-HCL、终浓度为10～50mmol/L的MgCl2，终浓度为0.1～1mmol/LCaCl2。进一步的，所述洗脱液包括：终浓度为5～20mmol/L的Tris-HCL(pH＝8.0)；优选终浓度为10mmol/L的Tris-HCL(pH＝8.0)。一种利用上述试剂盒提取RNA的方法，包括如下步骤：(1)将样本于离心管中加入裂解液裂解；(2)向(1)中裂解后的混合液中加入蛋白酶K溶液；再加入异丙醇吹打混匀；(3)向(2)所得溶液中加入提取磁珠，混合；(4)将(3)所得混合液瞬时离心约5s，吸弃液体；(5)向(4)离心管中加洗涤液Ⅰ进行洗涤，吸弃洗涤液体，晾干；(6)向(5)离心管中加DNaseⅠ和DNaseⅠBuffer消化；(7)向(6)离心管中加洗涤液Ⅰ，混合，瞬时离心约5s，吸弃液体；(8)向(7)离心管中加入洗涤液Ⅱ进行洗涤，吸弃洗涤液体，晾干；(9)向(8)离心管中加入洗脱液，充分震荡混匀；(10)将(9)所得混合液瞬时离心约5s，将洗脱液转移至新的离心管中备用。进一步的，所述RNA提取试剂盒可用于组织、培养细胞或全血等样本的RNA提取。进一步的，一种利用上述试剂盒提取组织RNA的方法，具体包括如下步骤：(1)切取组织样本：切取约芝麻粒大小的组织，加入无核酶离心管中；(2)利用裂解液的高盐及强RNase抑制环境，加入200μl裂解液，吹打疏散组织，可使裂解液加速进入组织内部抑制RNase；加入400μl组织消化液；加入蛋白酶K(10mg/ml)10μl。(3)利用裂解液及组织消化液的高盐环境，将(2)中的混合液在2000rpm，55℃，10～20min(优选20min)的条件下充分裂解消化样本，释放组织总核酸，之后向裂解后的混合液中加入与混合液体积相同量的异丙醇吹打混匀；(4)使用无菌枪头将离心管中的液体全部转移至新的无核酸酶离心管，向(3)中所得混合溶液中加入10～20μl提取磁珠盖上离心管盖，将离心管置于垂直混匀仪上，室温混合10min，让磁珠与核酸充分结合；(5)取下(4)中的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种提取RNA的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括以下试剂：核酸提取磁珠、裂解液、蛋白酶K溶液、DNaseⅠ、DNaseⅠBuffer、洗涤液Ⅰ、洗涤液Ⅱ、洗脱液；所述裂解液包括：终浓度为1～5mol/L的异硫氰酸胍、终浓度为5～10mmol/L的柠檬酸钠、终浓度为0.5mol/L～2mol/L氯化锂、体积百分比为0.5～5％的Tween‑20、体积百分比为0.10％～2％乙酸钾、终浓度为0.05mg～1mg/ml的糖原，终浓度为10mmol/L～100mmol/L的DTT。

【技术特征摘要】
1.一种提取RNA的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括以下试剂：核酸提取磁珠、裂解液、蛋白酶K溶液、DNaseⅠ、DNaseⅠBuffer、洗涤液Ⅰ、洗涤液Ⅱ、洗脱液；所述裂解液包括：终浓度为1～5mol/L的异硫氰酸胍、终浓度为5～10mmol/L的柠檬酸钠、终浓度为0.5mol/L～2mol/L氯化锂、体积百分比为0.5～5％的Tween-20、体积百分比为0.10％～2％乙酸钾、终浓度为0.05mg～1mg/ml的糖原，终浓度为10mmol/L～100mmol/L的DTT。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括组织消化液；所述组织消化液包括：终浓度为10～50mmol/L的Tris-Hcl、终浓度10～20mmol/LCaCl2，终浓度为10mmol/L～100mmol/L的DTT。3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述蛋白酶K溶液，浓度为5～10mg/ml。4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述洗涤液Ⅰ包括：终浓度0.1～0.5mol/L异硫氰酸胍、终浓度50～100mmol/L的Tris-HCl、终浓度为5～10mmol/L的EDTA、体积百分比浓度为0.5％～5％的Tween-20、终浓度为0.1～1mol/L的可溶性盐LiCl、终浓度为10mmol/L～100mmol/L的DTT；体积百分比浓度30～80％的异丙醇。5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述洗涤液Ⅱ包括：...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱奇，王灵敏，廖传荣，刘丽，
申请(专利权)人：广州奇辉生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44