一种制备cfDNA参考品的方法技术

本发明专利技术提供了一种制备cfDNA标准品或参考品的方法，包括将从细胞中提取的基因组DNA进行超声打断处理，形成150‑200bp大小的DNA片段。本发明专利技术还提供了由该方法制备的cfDNA标准品或参考品及其制备用于定量和定性检测体液中游离DNA或其基因突变中产品的应用。

【技术实现步骤摘要】
一种制备cfDNA参考品的方法
本专利技术涉及生物医药领域，具体涉及基因检测、临床检验领域。
技术介绍
循环游离DNA(cfDNA)是指凋亡或坏死的细胞进入血管中所释放的DNA片段，多见于由坏死的肿瘤细胞分泌，主要存在于细胞外的环境中，呈游离状态。主要存在于血浆或血清、脑脊液、胃液、胆汁、淋巴液、尿液、滑膜液等体液中。游离DNA因为检测方便快捷，而且具非侵入性等特点，那么，随着肿瘤分子生物学的深入研究，血液中游离DNA结合各类分子生物学检测技术，有望成为具有一定敏感性及高特异性的肿瘤临床诊断方法。肿瘤细胞死亡后将释放自身的DNA片段到血循环中，即循环肿瘤DNA(ctDNA)。多项研究显示，血液中的循环肿瘤DNA可以作为一类特异性的分子标志物用于肿瘤的检测和预后监测。检测游离DNA中肿瘤特异性的基因突变具有较好的临床价值，如EGFR、KRAS和TP53基因等这些在多种类型肿瘤中具有高突变频率的基因其检测对肿瘤的早期诊断具有重要的临床意义。肿瘤cfDNA片段大小在100-200bp，主要长度在166bp左右，浓度低。随着液体活检的应用，越来越多的检测试剂盒检测的样本类型为cfDNA，因此模拟cfDNA样本的短片段DNA制备工艺变得尤为重要。此类短片段DNA可以作为检测试剂盒的参考品和质控品，也可以作为一种标准品用于检测不同检测方的能力测试。
技术实现思路
本专利技术公开了一种将大片段基因组DNA制备成短片段DNA的方法，该短片段DNA更接近和模拟了人血浆cfDNA片段大小的特点，更适合用作人血浆cfDNA的参考品。一方面，本专利技术公开了一种制备cfDNA标准品或参考品的方法，包括以下步骤：将从细胞中提取的基因组DNA进行超声打断处理400秒至480秒。进一步，上述方法还包括，超声负载率为30％至50％，以形成150bp至200bp大小的DNA片段。在一个具体实施例中，上述方法中使用CovarisLE220R超声打断仪进行超声。在一个具体实施例中，CovarisLE220R超声打断仪的设置参数为以下参数的至少一种：峰值入射功率值为450；温度为7℃；水位值为6。在一个实施例中，上述方法中所述基因组DNA的质量为1μg至5μg的任一值，体积可以为130μL。在一个实施例中，所述细胞为肿瘤细胞，优选为H1975、A549、PC9中的至少一种。在一个实施例中，上述方法还包括以下步骤：将来源于H1975、A549、或PC9通过超声打断形成的DNA片段进行掺比，制备突变位点L858R、T790M、Exon19del均为相同突变比例的cfDNA标准品或参考品，其中突变比例优选为0.1％、5％、或20％。在一个具体实施例中，所述超声打断处理时间优选为400秒至450秒，例如400秒至440秒、410秒至430秒、415秒至425秒、更优选为420秒。在一个具体实施例中，所述负载率优选为20％至40％，例如25％至35％，更优选为30％。在一个具体实施例中，所述基因组DNA的质量优选为5μg。在一个实施例中，在上述方法中，超声后DNA片段的主浓度峰在150-200bp之间，DNA拷贝数的理论回收率60％以上。另一方面，本专利技术还提供了如前任一所述的方法制备的cfDNA标准品或参考品。在一个实施例中，所述的cfDNA标准品或参考品包括150bp至200bp大小的DNA片段，所述cfDNA标准品或参考品进一步优选包括药学上可接受的DNA缓冲液，例如Tris-HCL缓冲液、TE缓冲液等；上述cfDNA标准品或参考品在使用时，还可与血液基质例如血清、血浆、或全血进行混合后使用，其中血液基质可以是天然的，也可是人造的。另一方面，本专利技术进一步公开了上述cfDNA标准品或参考品在制备用于定量和定性检测体液中游离DNA或其基因突变中产品的应用，所述体液包括血浆、血清、脑脊液、胃液、胆汁、淋巴液、尿液、滑膜液中的至少一种。在一个实施例中，上述cfDNA标准品或参考品中还包括作为基质的体液，所述体液包括血浆、血清、脑脊液、胃液、胆汁、淋巴液、尿液、滑膜液中的至少一种，其中体液可以是天然的，也可以是人造的。有益效果本专利技术找到了合适的超声波片段化基因组DNA的条件，制备的短片段DNA，更接近和模拟了人血浆cfDNA片段的特点、更适合用作人血浆cfDNA的参考品。另外，该方法操作简单、重复性好、回收率高。附图说明图1示出PC9超声打断后2100图谱。具体实施方式下面将通过具体描述，对本专利技术作进一步的说明。除非另有限定，本文中所使用的所有技术和科学术语具有与本专利技术所属
的普通技术人员通常理解相同的含义。本申请中，单数形式“一个”、“该”包括复数对象，除非上下文另外清楚规定。定义如本文所用的术语“基因组DNA”、“gDNA”可互换，是指细胞经过试剂盒提取得到的基因组DNA，其中细胞可以是肿瘤细胞，也可以是其他来源的细胞，例如可以是PC6细胞。如本文所用的术语“循环游离DNA”、“cfDNA”可互换，是指凋亡或坏死的细胞进入血管中所释放的DNA片段，包括由坏死的肿瘤细胞分泌，主要存在于细胞外的环境中，呈游离状态。主要存在于血浆或血清、脑脊液、胃液、胆汁、淋巴液、尿液、滑膜液等体液中。如本文所用的术语“循环肿瘤DNA”、ctDNA可互换，是指肿瘤细胞死亡后将释放自身的DNA片段到血循环中。如本文所用的术语“校准品”、“标准品”、“对照品”可替换，是指标准物质，作为一种衡量标准，用于鉴定、检查、含量测定的标准物质。本文中所述的cfDNA标准品是指在测定细胞外的环境中呈游离状态的DNA的含量诸如基因突变量时的标准物质。如本文所用的术语“参考品”是指定性测定生物效价、生物活性的标准物质，作为疾病诊断的参考物质。如本文所用的术语“负载率”也称“负载比”，是指负载率指该变压器实际承担的负荷与其容量之比，本专利技术中指超声装置的变压器实际承担的负荷与其容量之比。实施例通过以下实施例进一步说明本专利技术。提供实施例仅用于说明目的，并且不应被解释为以任何方式限制本专利技术的范围或内容。实施例1：短片段DNA的制备方法通过超声打断仪(CovarisLE220R)处理细胞系PC9的gDNA，进而得到随机打断的DNA片段，对仪器相应的参数进行调整优化，经过大量繁杂的多因素参数优化工艺考察，进而使得随机打断的DNA片段集中在100-200bp，最终确定优化后的一种主要工艺参数如下表：表1.一种主要工艺参数表采用上述参数，将PC9人肺癌细胞的DNA基因组超声打断后，2100图谱显示超声后的DNA短片段集中在0-300bp之间、主浓度峰在100-200bp之间(图1)。进一步，将样本总量5μg、样本体积130μL、反应时间420秒，负载因素30％条件下共进行4次重复实验，其中20180116-5μg130μL、PC95μg420s-1和PC95μg420s-2为其中的三次数据对比图，akj0.05(安可济公司的商业化标准品，通过酶切制备)和horizon分别为商业购买的cfDNA标准品。实验结果显示，相比商业购买的cfDNA标准品，本专利技术制备方法制备的产品，其重复性很好且也可以获得长度为100-200bp的短片段DNA。实施例2超声打断时间的对比实验使用CovarisLE220R将细胞系基因本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种制备cfDNA标准品或参考品的方法，包括以下步骤：使用基因组DNA进行超声打断处理，时间为400秒至480秒。

【技术特征摘要】
1.一种制备cfDNA标准品或参考品的方法，包括以下步骤：使用基因组DNA进行超声打断处理，时间为400秒至480秒。2.如权利要求1所述方法，其中超声负载率为30％至50％。3.如权利要求1或2所述方法，其中所述基因组DNA的质量为1μg至5μg。4.如权利要求1或2所述的方法，其中所述基因组DNA为肿瘤细胞的基因组DNA，优选所述肿瘤细胞为H1975、A549、PC9中的至少一种。5.如权利要求4所述的方法，还包括以下步骤：将来源于H1975、A549、或PC9通过超声打断形成的DNA片段进行掺比，制备突变位点L858R、T790M、Exon19del均为相同突变比例的cfDNA标准品或参考品，其中突变比例优选为0.1％、5％、或20％。6.如权利要求1至5任一项所述的方法，所述超声打断处理优选为400秒至450秒，更优选为420秒。7.如权利要求1至5任一项所述的方法，所述负载率优选为20％至40％，...

【专利技术属性】
技术研发人员：魏小元，卢丹，
申请(专利权)人：上海奥测医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31