一种免疫组库高通量测序文库的构建方法技术

本发明专利技术是基于5'RACE的原理，同时引入UM即分子条形码的文库构建方案，具体为在恒定区设计单引物进行逆转录，可等效扩增出所有类型TCR/BCR CDR全长序列，同时因引入UMI，可对后续的PCR或测序过程中引入的错误进行纠正。本发明专利技术可满足微量样品，低至100个细胞的建库的实验要求，并且可等效扩增出TCR/BCR的CDR全长序列。

【技术实现步骤摘要】
一种免疫组库高通量测序文库的构建方法
本专利技术属于生物医药服务领域，尤其是涉及一种免疫组库高通量测序文库的构建方法。
技术介绍
免疫组库是指某个个体在任何特定时间点其循环系统中所有功能多样性B细胞和T细胞的总和。T细胞和B细胞分别介导机体的细胞免疫与体液免疫应答，分别通过其表面的细胞受体(TCR或BCR)来识别和结合抗原，进而发挥功能清除病原体或肿瘤细胞等。一个T或B淋巴细胞只表达一种TCR或BCR，每条TCR或BCR都由可变区和恒定区组成，不同克隆T、B细胞的恒定区可相同，但可变区不同，人体T、B细胞总数约1012，因而具有复杂的识别抗原受体的多样性。随着二代测序技术的问世，人们通过多重PCR或SMARTRACE法扩增TCR/BCR全长或CDR3区序列(主要是TCR的β链或BCR的重链)，再结合高通量测序技术，可准确评估机体免疫组库的多样性及每种T、B细胞克隆组成及变化之间的关系。高通量测序技术(High-throughputsequencing,HTS)是对传统Sanger测序(称为一代测序技术)革命性的改变，一次对几十万到几百万条核酸分子进行序列测定，因此在有些文献资料中称其为下一代测序技术，足见其划时代的改变，同时高通量测序使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析称为可能，所以又被称为深度测序。现有多种文库构建方法，如基于多重PCR的文库构建方法，以DNA为模板，针对可变区(CDR3区域)设计许多对引物，扩增出CDR3区段，再连接高通测序相关接头，如中国专利201410398360.1公开了一种基因多态性区域测序文库及其制备方法，具体包括以下步骤:(1)根据基因多态性区域特征，设计引物，通过PCR扩增得到包含保守区域和多态性区域的DNA片段；(2)向PCR扩增所得DNA片段中加入核酸外切酶，控制核酸外切酶的浓度与反应时间或者控制核酸外切酶的反应温度与反应时间，水解DNA片段；(3)向步骤(2)所得DNA片段的水解产物中加入单链核酸酶，消化DNA突出单链，得到DNA混合片段。该专利技术制备基因多态性区域测序文库的方法特异性高、快速，可用于高度多态性区域的测序分型。但基于多重PCR的文库构建方法存在以下缺点，如因存在几十种引物扩增，扩增体系复杂；多重引物设计来自已知参考序列，不能充分捕捉到人类等位基因突变序列；多种引物扩增效率可能存在偏倚(bias)，不能等效扩增；与RNA构建文库相比，DNA所需PCR反应体系较大。再如基于5'RACE的文库构建方法，以mRNA为模板，在恒定区设计引物逆转出TCR或BCR的全长序列，再经过2轮PCR富集这一目的序列，最后连接高通测序相关接头，如中国专利201510488029.3公开了一种检测血浆cfDNA中BCR和TCR免疫组库的方法，包括血浆cfDNA提取、BCRH链的全长多重PCR扩增和TCRβ链CDR3多重PCR扩增、两种扩增产物等体积混合后再进行一次PCR扩增、高通量测序、免疫组库精准信息分析，该专利技术方法能够同时检测血浆cfDNA中BCR和TCR，实现精准信息分析和免疫组库各亚克隆的精确定量，在无创检测领域具有广阔的应用前景。但基于5'RACE的文库构建方法也存在相应的缺点：文库构建中的PCR步骤及上机测序过程可能引入错误。本专利技术的目的在于克服上述现有技术的缺陷而提供一种高效率、高成功率的免疫组库高通量测序文库的构建方法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的缺陷而提供一种高效率、高成功率的免疫组库高通量测序文库的构建方法。除非另外定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有与本专利技术所属
的普通技术人员通常理解的相同意义。术语：UMI全称为uniquemolecularidentifiers，由随机碱基组成，本专利技术设计的UMI的结构为UNNNNUNNNNUNNNNU，全长为15bp，为四个U碱基框架，两两之间包含四个随机碱基，其随机数目为412个，具有极好的随机性；引物TSO：此序列由一段UMI序列与一段通用序列组成；UDG酶：切割序列中的U碱基，TSO中的UMI序列包含U碱基，在完成逆转录后，加入UDG酶即可降解人工加入的包含UMI序列的TSO引物，避免干扰后续的扩增序列中UMI的技术；本专利技术是基于5'RACE的原理，同时引入UMI(分子条形码)的文库构建方案：在恒定区设计单引物进行逆转录，可等效扩增出所有类型TCR/BCRCDR全长序列，同时因引入UMI，可对后续的PCR或测序过程中引入的错误进行纠正。为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案为：一种免疫组库高通量测序文库的构建方法。当用于微量样品时，所述一种免疫组库高通量测序文库的构建方法包括以下步骤：1.cDNA模板的制备(1)细胞裂解将100-25000个淋巴细胞加入细胞裂解液中进行裂解，得到裂解物；(2)mRNA分离、逆转录、模板替换及UDG酶处理a、使用Dynabeads磁珠分离技术分离提纯步骤(1)得到的裂解物中的mRNA，获得纯化的mRNA；b、按照下表1配置逆转录反应体系A，并立即加入步骤(2)-a获得的纯化的mRNA，进行逆转录PCR，PCR程序为：50℃，1h；72℃，10min，得到PCR产物A；表1c、向步骤(2)-b得到的产物A中加入1uluracilDNAglycosylase，混合均匀后于PCR仪上继续进行逆转录反应，PCR反应程序为37℃,40min，得到PCR产物B；d、回收纯化产物B，即得到用于后续扩增的cDNA模板；2、第一次PCR反应(1)、PCR反应体系为：表2(2)、PCR反应程序为：表3：(3)、对第一次PCR反应的产物进行纯化，得到PCR产物C；3、第二次PCR(1)、PCR反应体系为：表4(2)、PCR反应程序为：表5(3)、对第二次PCR反应的产物进行纯化，得到PCR产物D；4、测序文库构建(1)、将步骤(3)得到的PCR产物D连接测序接头，得到测序文库样品；(2)、对测序文库样品筛选并质检；上述步骤(1)中所述的细胞裂解液选自分离mRNA的试剂盒DynabeadsmRNADIRECTMicroKit(TermoFisher)中带有的试剂；上述步骤(1)中每10000(细胞数量)淋巴细胞加入100μL的细胞裂解液；上述步骤(2)-c中每10μL反应物A中加入1μL的uracilDNAglycosylase；上述步骤(2)-d中tris-HCl的浓度为2-20mM；上述步骤(2)-d中所述的洗涤磁珠，为用tris-HCl反复洗涤磁珠2-5次；上述步骤1-(2)-b中所述的TSOprimer核苷酸序列下列核苷酸序列：当细胞受体为TCR时：TSOprimer的核苷酸序列包含或由SEQIDNO:1组成，其中末端的4个G为核糖核酸中的鸟嘌呤。当细胞受体为BCR时：TSOprimer的核苷酸序列包含或由SEQIDNO:2组成，其中末端的4个G为核糖核酸中的鸟嘌呤。上述步骤2-(1)中所述的Primer2核苷酸序列为下列核苷酸序列：当细胞受体为TCR时，primer2的核苷酸序列包含或由SEQIDNO:3组成；当细胞受体为BCR时，primer2的核苷酸序列包含或由SEQIDNO:4组成；上述步骤2-(1)中所述的Primer3核苷酸序列为下列核本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于微量样品的免疫组库高通量测序文库的构建方法，其特征在于，具体包括以下步骤：(1)、cDNA模板的制备；1)细胞裂解；2)mRNA分离、逆转录、模板替换及UDG酶处理；(2)、第一次PCR反应；(3)、第二次PCR反应；(4)、测序文库构建；1)、将步骤3)得到的PCR产物D连接测序接头，得到测序文库样品；2)、对测序文库样品筛选并质检。

【技术特征摘要】
1.一种用于微量样品的免疫组库高通量测序文库的构建方法，其特征在于，具体包括以下步骤：(1)、cDNA模板的制备；1)细胞裂解；2)mRNA分离、逆转录、模板替换及UDG酶处理；(2)、第一次PCR反应；(3)、第二次PCR反应；(4)、测序文库构建；1)、将步骤3)得到的PCR产物D连接测序接头，得到测序文库样品；2)、对测序文库样品筛选并质检。2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)、cDNA模板的制备；1)细胞裂解将100-25000个淋巴细胞加入细胞裂解液中进行裂解，得到裂解物；2)mRNA分离、逆转录、模板替换及UDG酶处理；a、使用Dynabeads磁珠分离技术分离提纯步骤1)得到的裂解物中的mRNA，获得纯化的mRNA；b、按照下表1配置逆转录反应体系A，并立即加入步骤2)-a获得的纯化的mRNA，进行逆转录PCR，PCR程序为：50℃，1h；72℃，10min，得到PCR产物A；c、向步骤2)-b得到的cDNA产物A中加入1uluracilDNAglycosylase，混合均匀后于PCR仪上继续进行逆转录反应，PCR反应程序为37℃,40min，得到产物B；d、回收纯化产物B，即得到用于后续扩增的cDNA模板；(2)、第一次PCR反应1)、PCR反应体系为：2)、PCR反应程序为：3)、对第一次PCR反应的产物进行纯化，得到PCR产物C；(3)、第二次PCR1)、PCR反应体系为：2)、PCR反应程序为：3)、对第二次PCR反应的产物进行纯化，得到PCR产物D；(4)、测序文库构建；1)、将步骤3)得到的PCR产物D连接测序接头，得到测序文库样品；2)、对测序文库样品筛选并质检。3.如权利要求2所述的构建方法，其中步骤(1)-2)-b中所述的TSOprimer的核苷酸序列为下列核苷酸序列：当细胞受体为TCR时：TSOprimer的核苷酸序列包含或由SEQIDNO:1组成，其中末端的4个G为核糖核酸中的鸟嘌呤；当细胞受体为BCR时：TSOprimer的核苷酸序列包含或由SEQIDNO:2组成，其中末端的4个G为核糖核酸中的鸟嘌呤。4.如权利要求2所述的构建方法，其中步骤2-(1)中所述的primer2核苷酸序列为下列核苷酸序列：当细胞受体为TCR时，primer2的核苷酸序列包含或由SEQIDNO:3组成；当细胞受体为BCR时，primer2的核苷酸序列包含或由SEQIDNO:4组成；5.如权利要求2所述的构建方法，其中步骤2-(1)中所述的Primer3核苷酸序列为下列核苷酸序列：当细胞受体为人类TCRbeta时,primer3的核苷酸序列包含或由SEQIDNO:5组成；当细胞受体为人类TCRalpha时,primer3的核苷酸序列包含或由SEQIDNO:6组成；当细胞受体为老鼠TCRbeta时,primer3的核苷酸序列包含或由SEQIDNO:7组成；当细胞受体为老鼠TCRalpha时,primer3的核苷酸序列包含或由SEQIDNO:8组成；当细胞受体为人类IgG/IgE重链时,primer3的核苷酸序列包含或由SEQIDNO:9组成；当细胞受体为人类IgA重链时,primer3的核苷酸序列包含或由SEQIDNO:10组成；当细胞受体为人类IgM重链时,primer3的核苷酸序列包含或由SEQIDNO:11组成；当细胞受体为人类IgD重链时,primer3的核苷酸序列包含或由SEQIDNO:12组成；当细胞受体为人类IgL轻链时,primer3的核苷酸序列包含或由SEQIDNO:13组成；当细胞受体为人类IgK轻链时,primer3的核苷酸序列包含或由SEQIDNO:14组成；当细胞受体为老鼠IgG1/IgG2重链时，primer3的核苷酸序列包含或由SEQIDNO:15组成；当细胞受体为老鼠IgG3重链时，primer3的核苷酸序列包含或由SEQIDNO:16组成；当细胞受体为老鼠IgA轻链时，primer3的核苷酸序列包含或由SEQIDNO:17组成；当细胞受体为老鼠IgM重链时，primer3的核苷酸序列包含或由SEQIDNO:18组成；当细胞受体为老鼠IgD重链时，primer3的核苷酸序列包含或由SEQIDNO:19组成；当细胞受体为老鼠IgE重链时，primer3的核苷酸序列包含或由SEQIDNO:20组成；当细胞受体为老鼠IgL轻链时，primer3的核苷酸序列包含或由SEQIDNO:21组成；当细胞受体为老鼠IgK轻链时，primer3的核苷酸序列包含或由SEQIDNO:22组成。6.如权利要求2所述的构建方法，其中步骤3-(1)中所述的Primer4核苷酸序列为下列核苷酸序列：当细胞受体为TCR时，primer4的核苷酸序列包含或由SEQIDNO:23组成；当细胞受体为BCR时，primer4的核苷酸序列包含或由SEQIDNO:24组成；7.如权利要求2所述的构建方法，其中步骤3-(1)中所述的Primer5核苷酸序列为下列核苷酸序列：当细胞受体为TCR时，primer5的核苷酸序列包含或由SEQIDNO:25组成；当细胞受体为BCR时，primer5的核苷酸序列包含或由SEQIDNO:26组成。8.一种用于常规量样品的免疫组库高通量测序文库的构建方法，其特征在于，具体包括以下步骤：(1)、cDNA模板的制备；1)总RNA提取；2)逆转录、模板替换及UDG酶处理；(2)、第一次PCR反应；(3)、第二次PCR；(4)、测序文库构建；1)、将步骤(3)得到的PCR产物I连接测序接头，得到测序文库样品；2)、对测序文库样品筛选并质检。9.如权利要求8所述的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)cDNA模板的制备；1)总RNA提取；将Trizol加入淋巴细胞中，提取总RNA，并质检；2)逆转录、模板替换及UDG酶处理；a、按照下表6配置反应体系B；并立即加入步骤1-(1)中提取的RNA；c、混匀步骤1-(2)反应体系B，瞬时离心后置于PCR仪上反应，反应程序为70℃，2min；42℃，1-3min，得到产物E；d、配置如表7逆转录反应体系C，并将逆转录反应体系C加入步骤1-(2-)-c中的反应液中；e、将配置的逆转录反应体系C加入反应体系B中，混合均匀得反应体系D，置于PCR仪上，反应程序为42℃，60min，得到反应产物F；f、向步骤...

【专利技术属性】
技术研发人员：李芬香，李雪飞，王勇斯，董少玲，王晓丹，
申请(专利权)人：广州华银医学检验中心有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44