一种基于计算生物学筛选提高沉香倍半萜合酶活性的关键氨基酸位点的方法技术

本发明专利技术公开了一种基于计算生物学筛选提高沉香倍半萜合酶活性的关键氨基酸位点的方法，包括如下步骤：1)获得沉香等68条倍半萜合酶相关序列；2)通过Modeltest、PAUP*和MrBayes等软件构建倍半萜合酶系统发育树；3)采用PAML软件的位点模型、枝模型和枝位点模型检测倍半萜合酶的正选择位点；4)对沉香倍半萜合酶进行同源建模，通过PyMOL软件显示正选择位点；5)运用Discovery Studio软件进行沉香倍半萜合酶突变体的计算分析。结果表明，247Q、403D、412P、426Y、470G和538S等6个正选择位点与沉香倍半萜合酶功能位点或功能保守区密切相关；D403R、G470Q和S538K突变后有利于提高沉香倍半萜合酶活性与稳定性。本发明专利技术方法基于计算生物学，操作简单，能够实现经济快捷筛选提高沉香倍半萜合酶活性的关键氨基酸位点。

【技术实现步骤摘要】
一种基于计算生物学筛选提高沉香倍半萜合酶活性的关键氨基酸位点的方法
本专利技术涉及一种基于计算生物学筛选提高沉香倍半萜合酶活性的关键氨基酸位点的方法。
技术介绍
沉香是传统的名贵中药，印度尼西亚、马来西亚和越南是沉香的主要出口国。在中国，沉香主要分布在海南、广东等省。沉香具有行气止痛、温中止呕、纳气平喘等功效，主要用于治疗风湿病和咳嗽。此外，沉香还广泛应用于天然香料、精油等。高品质沉香价格可达每千克1000美元，具有巨大的商业价值，被誉为“植物中的钻石”，市场需求量很大。而沉香是在沉香属植物受到自然或人为伤害后形成，自然条件下沉香结香非常缓慢。因此，沉香的供应量远远不能满足市场需求，迫切需要发现一种提高沉香产量的新方法。白木香(Aquilariasinensis(Lour.)Spreng)为瑞香科沉香属植物，是生产芳香类药材国产沉香的主要资源植物和正品来源。倍半萜是沉香的主要药效成分，是白木香适应环境而产生的次生代谢产物。沉香倍半萜合酶（AquilariasinensisSesquiterpenesynthase）是沉香生物合成的关键酶，其活性高低直接影响沉香的结香量。然而，天然的倍半萜合酶活性很低，成为制约代谢工程量产倍半萜的关键技术瓶颈。研究表明，基于适应性进化理论对蛋白质进行正选择位点分析，为深化阐明蛋白质活性位点与功能的相互关系，改良酶的活性提供了重要的信息。正选择也指达尔文选择或定向选择，即把具有提高个体适合度的有利突变等位基因在某个群体中固定下来的选择作用，以适应不同的生存环境。正选择作用在适应性进化机制中处于核心地位，当群体中出现能够提高个体生存力及繁衍力的突变时，具有该基因型的个体较其它个体将更可能存活并遗留更多子代，导致突变基因型最终得以在整个群体中扩散和固定。而基因水平的适应性进化的一种重要方式是指基因通过正选择得到积累并保持有利突变，改变蛋白结构和功能，进而适应外界变化。正选择表现在蛋白质氨基酸序列上，其非同义置换率(dN)高于同义置换率(dS)。适应性正选择的研究既有助于对基因功能区的预测，为解决某些生物技术和生物医学难题提供了崭新的思路。植物在长期的生物进化过程中，为了提高适应环境的生存能力，会产生一些对生态环境高度适应的次生代谢物质，这些次生代谢物质具有自身防御和繁衍后代的重要功能。植物进化学家已在陆生植物中陆续发现了适应性进化的正选择作用，研究发现的正选择作用主要集中在与抗逆及生殖相关的基因。2008年美国科学家HowitzKT和SinclairDA在《Cell》提出了Xenohormesis效应假说，从进化与生态角度解释了由植物产生的次生代谢产物可使异养生物受益，增加其生存机会的原因。Xenohormesis效应假说也为从进化和生态角度理解植物类中药次生代谢产物的生物效应提供了理论支持。作为一类庞大的植物次生代谢产物群，倍半萜类化合物属于萜类家族，其C15结构包含三个异戊二烯单元。迄今已发现至少有300种倍半萜类化合物，大多是挥发性化合物。倍半萜类由倍半萜合成途径中的限速酶倍半萜合酶催化合成。然而，倍半萜合酶功能分化和基因进化的过程仍然是未知的。在本项目中，基于计算生物学，以沉香倍半萜合酶为目标序列，从陆生植物的倍半萜合酶基因中分析氨基酸和核苷酸残基的差异，利用位点模型、枝模型和枝位点模型来检测倍半萜合酶基因的正选择位点，并利用虚拟突变模拟正选择位点定点突变后对沉香倍半萜合酶功能和稳定性的影响，为筛选提高沉香倍半萜合酶活性的关键氨基酸位点提供了一种新方法。
技术实现思路
本专利技术的目的：基于计算生物学，检测及鉴定沉香倍半萜合酶的正选择位点，并利用虚拟突变模拟正选择位点定点突变后对沉香倍半萜合酶功能和稳定性的影响，为筛选提高沉香倍半萜合酶活性的关键氨基酸位点提供新方法。本专利技术技术方案如下：(1)被子植物倍半萜合酶基因以及蛋白质序列获得；(2)被子植物倍半萜合酶基因系统发育分析；(3)正选择位点检测；(4)蛋白质序列及三维结构上预测正选择位点对沉香倍半萜合酶功能保守区及活性的影响。(5)虚拟突变正选择位点及突变结果分析。本专利技术的优点及其效果：(1)本项目分析了植物倍半萜合酶的分子进化和结构特征。(2)本项目从分子进化角度检测倍半萜合酶在物种进化过程中潜在的有利突变位点，通过同源建模、虚拟突变等计算生物学方法探讨正选择位点与沉香倍半萜合酶功能进化的关系，为筛选提高沉香倍半萜合酶活性的关键氨基酸位点提供了一种新方法。具体实施方式：实施例一（1）植物倍半萜合酶基因以及蛋白质序列获得。从GenBank数据库中检索沉香倍半萜合酶蛋白质序列（GenBank号：AIT75876.1），并以AIT75876.1序列为目标序列，通过使用非冗余蛋白质数据库进行PSI-BLAST检索，从GenBank数据库中收集蛋白质序列和编码序列，排除所有预测、推定、部分、未命名和假设序列，只纳入全长编码序列。最终纳入68条倍半萜合酶蛋白质以及对应的编码序列，此序列数据集含68种陆生植物，包括66种被子植物（63种双子叶植物和3种单子叶植物）、苔藓植物和裸子植物。（2）被子植物倍半萜合酶基因系统发育分析。使用MUSCLE网络服务器（www.ebi.ac.uk/Tools/msa/muscle/）对68条蛋白质序列进行多重比对，参数设定为默认值。将比对好的蛋白质序列和编码序列导入PAL2NAL（www.bork.embl.de/pal2nal/）中构建的多重密码子比对。经过PAL2NAL对齐后，通过MEGA7软件将数据集文件转换为nexus格式进行系统发育分析。根据68条比对好基因序列nexus格式文件，使用Modeltest3.7和PAUP*4.0软件计算优化参数，首先通过PAUP*4.0中的AkaikeInformationCriterion（AIC）选定最佳氨基酸替代模型评估建树分析，然后PAUP*4.0中PhyML程序的distancemethods和maximumlikelihood（ML）方法进行优化评估。最后，根据Modeltest3.7评估的最佳模型（GTR+I+G）获得最优设置参数，通过MrBayes3.1.2利用最优设置参数重建倍半萜合酶基因系统发育树。在重建过程中，使用贝叶斯后验概率（PP）来评估系统发育树中的所有进化枝支持率。（3）正选择位点检测。基于MrBayes软件构建系统发育关系树，采用PAML4.9软件的位点模型、枝模型和枝位点模型检测倍半萜合酶的正选择位点。这三种模型均通过codeml应用程序计算非同义替代(dN)和同义替代(dS)比值(ω=dN/dS)。ω值是自然选择的度量，其通过最大似然法估计，ω>1表明某些进化枝或位点受到正选择；位点模型、枝模型和枝位点模型均通过不同嵌套模型检测正选择，嵌套模型包括空模型和替代模型。空模型不允许正选择位点(ω>1)存在，替代模型允许正选择位点(ω>1)存在。在实际应用中，似然比检验(LRT)用来评估每对嵌套模型是否具有统计学意义。嵌套模型的两倍对数似然比值之差(2ΔlnL)遵循χ2分布，自由度(df)为空模型和替代模型中np值之差，P<0.05时表明替代模型比空模型更显著，差异具本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于计算生物学筛选提高沉香倍半萜合酶活性的关键氨基酸位点的方法，其特征在于该方法包括以下步骤：（1）从GenBank数据库中检索沉香倍半萜合酶蛋白质序列（GenBank号：AIT75876.1），并以AIT75876.1序列为目标序列，通过使用非冗余蛋白质数据库进行PSI‑BLAST检索，从GenBank数据库中收集蛋白质序列和编码序列，最终纳入68条倍半萜合酶蛋白质序列以及68条对应的编码序列，此序列数据集含68种陆生植物，包括66种被子植物（63种双子叶植物和3种单子叶植物）、苔藓植物和裸子植物；（2）通过Modeltest 3.7获得最佳模型（GTR + I + G），利用PAUP* 4.0软件计算最优设置参数，运用MrBayes 3.1.2构建倍半萜合酶基因系统发育树；（3）采用PAML 4.9软件的位点模型、枝模型和枝位点模型检测倍半萜合酶的正选择位点；（4）利用SWISS‑MODEL（https://swissmodel.expasy.org/）进行沉香倍半萜合酶同源建模，PyMOL软件显示正选择位点在沉香倍半萜合酶三维结构上的分布位置，并预测其对酶结构和功能的潜在影响；（5）运用Discovery Studio中的CHARMM forcefield、Calculate Mutation Energy (Stability)、Electrostatic Potential 和“Build Mutant”模块进行沉香倍半萜合酶突变体的计算分析。...

【技术特征摘要】
1.一种基于计算生物学筛选提高沉香倍半萜合酶活性的关键氨基酸位点的方法，其特征在于该方法包括以下步骤：（1）从GenBank数据库中检索沉香倍半萜合酶蛋白质序列（GenBank号：AIT75876.1），并以AIT75876.1序列为目标序列，通过使用非冗余蛋白质数据库进行PSI-BLAST检索，从GenBank数据库中收集蛋白质序列和编码序列，最终纳入68条倍半萜合酶蛋白质序列以及68条对应的编码序列，此序列数据集含68种陆生植物，包括66种被子植物（63种双子叶植物和3种单子叶植物）、苔藓植物和裸子植物；（2）通过Modeltest3.7获得最佳模型（GTR+I+G），利用PAUP*4.0软件计算最优设置参数，运用MrBayes3.1.2构建倍半萜合酶基因系统发育树；（3）采用PAML4.9软件的位点模型、枝模型和枝位点模型检测倍半萜合酶的正选择位点；（4）利用SWISS-MODEL（https://swissmodel.expasy.org/）进行沉香倍半萜合酶同源建模，PyMOL软件显示正选择位点在沉香倍半萜合酶三维结构上的分布位置，并预测其对酶结构和功能的潜在影响；（5）运用DiscoveryStudio中的CHARMMforcefield、CalculateMutationEnergy(Stability)、ElectrostaticPotential和“BuildMutant”模...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘镛，黄遵楠，陈镜安，吕思敏，
申请(专利权)人：广东医科大学，
类型：发明
国别省市：广东,44